TGFβ信號通路介導(dǎo)激活成纖維細胞促進胚胎肝祖細胞向膽管發(fā)育的研究.pdf

1、目的：
　　胚胎肝祖細胞可分化為成熟的肝細胞和膽管細。在胎肝發(fā)育中，分布在門靜脈周圍的肝祖細胞分化為膽管細胞，而分布肝實質(zhì)中遠離門靜脈的肝祖細胞則分化為肝細胞。本研究探索TGFβ信號通路在膽管發(fā)育中的作用，及其可能的調(diào)控機制。
　　方法：
　?、艑⒎蛛x得到的小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）培養(yǎng)至第二代，分成4組，分別用普通培養(yǎng)液、5ng/mL TGFβ1、5ng/mL TGFβ1+10μ M TGFβ R1抑制劑（SB5

2、25334）及10μ M TGFβ R1抑制劑（SB525334）處理72h。用熒光激活細胞篩選法（FACS）分選DLK1表面抗原陽性的小鼠胚胎肝細胞,并和肌成纖維細胞或成纖維細胞Transwell共培養(yǎng)或者單獨培養(yǎng)。細胞免疫熒光檢測MEFs處理72h后α﹣SMA的表達，檢測剛分選和共培養(yǎng)4、6d的DLK1+細胞的甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）及細胞角蛋白19（CK19）抗原的表達。qRT-PCR檢測肌成纖維細胞和成纖維細胞α﹣S

3、MA、HGF、TGFβ1、Jagged1、PTN、MDK、IGF1及IGF2等基因的表達,檢測胎肝祖細胞共培養(yǎng)6d后，CK19、 ALB、 AFP、Sox9等基因表達。⑵孕10.5的C57孕鼠共8只，隨機平均分成2組，藥物干預(yù)組腹腔注射 TGFβRI抑制劑 SB525334(5mg/kg)（溶于2.2%DMSO和97.8%玉米油），對照組腹腔注射等量的2.2% DMSO和97.8%玉米油為對照組，每天注射藥物，共干預(yù)8天。免疫熒光檢測E

4、14.5、E16.5、E18.5、P0、P10等各個階段胎肝或肝臟的α﹣SMA、Sox9或CK19的表達，免疫熒光檢測藥物干預(yù)組和對照組E18.5胎肝α﹣SMA、Jagged1、Sox9、CK19的表達。 qRT-PCR檢測藥物干預(yù)組和對照組 E18.5胎肝α﹣SMA、Jagged1、Sox9、CK19基因的表達。免疫熒光試驗計數(shù)周圍區(qū)域門脈周圍 Ck19+細胞的數(shù)量,計數(shù)在中央?yún)^(qū)域門脈周圍膽管的數(shù)量。然后計算每個動物中央?yún)^(qū)域的膽管數(shù)量

5、/門靜脈的比值和周圍區(qū)域的膽管細胞數(shù)量/門靜脈的比值。
　　結(jié)果：
　?、貴ACS分析示 DLK1+細胞占 E14.5胚胎肝細胞比例約10%～20%。體外共培養(yǎng)24 h內(nèi)分選的大部分DLK1+細胞開始分裂增殖,呈半貼壁生長。培養(yǎng)第2～3 d,細胞增殖明顯呈葡萄狀聚集生長,形態(tài)開始變成大圓形。共培養(yǎng)第4～6 d,部分細胞開始貼壁生長,并且形態(tài)成開始變梭形。細胞免疫熒光結(jié)果顯示, FACS分選的DLK1+細胞表達AFP和少量AL

6、B,但是不表達CK19。在共培養(yǎng)的第4天其開始表達CK19,和微弱表達 ALB；第6天,其高表達CK19,而幾乎不表達的ALB。以上結(jié)果說明分選DLK1+細胞大部分為mHPCs，與MEF共培養(yǎng)后可促進mHPCs增殖分化為膽管細胞。②免疫熒光證實在 E14.5～E18.5階段，α-SMA+肌成纖維細胞主要分布在門靜脈周圍，出生后包繞膽管。此外，肌成纖維細胞為門靜脈周圍表達 Jagged1的主要細胞,在膽管發(fā)育中起重要作用。阻斷TGFβ信號

7、通路后，中央?yún)^(qū)域的膽管數(shù)量/門靜脈的比值和周圍區(qū)域的膽管細胞數(shù)量/門靜脈的比值明顯減少（P＜0.05），說明TGFβ信號通路在膽管發(fā)育中發(fā)揮重要作用。當(dāng)阻斷TGFβ信號通路后，免疫熒光證實門靜脈周圍間質(zhì)細胞α-SMA的表達減少，qRT-PCR檢測進一步證實α-SMA基因的轉(zhuǎn)錄降低（P＜0.05），說明TGFβ信號通路調(diào)控門靜脈周圍間質(zhì)細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化。同時免疫熒光證實門靜脈周圍Jagged1的表達也相應(yīng)減少，qRT-PCR檢測進

8、一步證實Jagged1基因的轉(zhuǎn)錄降低（P＜0.05），說明TGFβ信號通路調(diào)控門靜脈周圍的間質(zhì)細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化進而調(diào)控 Jagged1表達。但膽管細胞Jagged1的表達未見減少，說明膽管細胞Jagged1的表達不受TGFβ信號通路的調(diào)控。在膽管發(fā)育中，Sox9為Notch通路的下游，阻斷TGFβ信號通路后，門靜脈周圍Sox9+膽管細胞明顯減少，qRT-PCR檢測進一步證實 Sox9基因的轉(zhuǎn)錄降低（P＜0.05），說明 TGFβ

9、信號通路可能通過Jagged1-Notch-Sox9機制途徑調(diào)控膽管的發(fā)育。
　　結(jié)論：
　　⑴應(yīng)用FACS技術(shù)成功從E14.5胎肝細胞中分選出DLK1+細胞并鑒定其大部分為mHPCs,在體外與MEFs Transwell共培養(yǎng)的條件下可擴增培養(yǎng)并誘導(dǎo)其分化為膽管細胞。⑵在Transwell共培養(yǎng)的條件下，與成纖維細胞相比，肌成纖維細胞促進mHPCs向膽管細胞分化作用更強，但促進其增殖的能力較低。⑶在動物體內(nèi)，TGFβ信號通