XAV939對(duì)肝星狀細(xì)胞中Wnt-β-catenin與Wnt-JNK通路的影響及肝復(fù)康的干預(yù)機(jī)制.pdf

1、目的:
　　 作為肝纖維化發(fā)生過程中的核心環(huán)節(jié)，活化的肝星狀細(xì)胞自身細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，引發(fā)肝纖維化。Wnt信號(hào)通路分為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路和非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，在人和動(dòng)物的生長(zhǎng)過程中控制著無數(shù)的生物學(xué)現(xiàn)象。關(guān)于Wnt/β-catenin與Wnt/JNK信號(hào)通路參與肝星狀細(xì)胞的活化的研究較多，但是研究結(jié)果存在著較大的分歧，對(duì)于Wnt/β-catenin與Wnt/JNK信號(hào)通路在肝星狀細(xì)胞活化過程中所起的作用尚不能明確。中藥肝復(fù)康經(jīng)

2、本實(shí)驗(yàn)室多次試驗(yàn)證實(shí)對(duì)Wnt/β-catenin及Wnt/JNK信號(hào)通路具有較好的抑制作用，而XAV939為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的特異性阻滯劑。本實(shí)驗(yàn)通過使用肝復(fù)康和XAV939作用于肝星狀細(xì)胞HSC-T6株，來觀察抑制Wnt/β-catenin和Wnt/JNK信號(hào)通路在肝星狀細(xì)胞活化中所起的作用。希望本研究探討肝星狀細(xì)胞活化的分子機(jī)制并對(duì)肝纖維化的治療有所幫助。
　　 方法:
　　 大鼠HSC-T6細(xì)胞株

3、用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基37℃，5％CO2混合氣體的孵箱中培養(yǎng)，傳代。待細(xì)胞條件合適時(shí)，細(xì)胞用不含血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24h。
　　 細(xì)胞于96細(xì)胞培養(yǎng)板孔板隨機(jī)分為:正常血清組（含10％正常大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基）;XAV9391umol/L組（含10％正常大鼠血清，XAV9391umol/L的DMEM培養(yǎng)基）;XAV9392umol/L(含10％正常大鼠血清，XAV9391umol/L的DMEM培養(yǎng)基);

4、XAV9394umol/L(含10％正常大鼠血清，XAV9394umol/L的DMEM培養(yǎng)基);XAV9398umol/L(含10％正常大鼠血清，XAV9398umol/L的DMEM培養(yǎng)基）肝復(fù)康治療組（含10％肝復(fù)康治療組大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基）。于37℃，5％CO2混合氣體的孵箱中培養(yǎng)48h。采用MTT法觀察肝星狀細(xì)胞在不同濃度XAV939及肝復(fù)康藥物血清的作用下細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況。
　　 細(xì)胞于六孔板中隨機(jī)分為:正常血清

5、組（含10％正常大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基）;XAV9391umol/L組（含10％正常大鼠血清，XAV9391umol/L的DMEM培養(yǎng)基）;XAV9392umol/L(含10％正常大鼠血清，XAV9391umol/L的DMEM培養(yǎng)基);肝復(fù)康治療組（含10％肝復(fù)康治療組大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基）。于37℃，5％CO2混合氣體的孵箱中培養(yǎng)48h。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptasepolymerasechain

6、reaction，RT-PCR)法測(cè)定細(xì)胞中collagenⅠ，a-SMA，β-catenin，Wnt1，F(xiàn)rizzled1，F(xiàn)rizzled2，MKK4，MKK7，JNK等基因mRNA的表達(dá)，免疫蛋白印跡法(westernblot)觀測(cè)細(xì)胞中β-catenin和p-JNK蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT法結(jié)果:與正常血清組相比，XAV9391umol/L，2umol/L，4umol/L，8umol/L組，以

7、及肝復(fù)康血清組均對(duì)肝星狀細(xì)胞的增值活化起到抑制作用，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其OD值，發(fā)現(xiàn)與正常組相比，其他五組的抑制作用較明顯(P＜0.05)。但是XAV9394umol/L，8umol/L組與XAV9392umol/L組差別無顯著性。
　　 2.RT-PCR法結(jié)果:與正常血清組相比，肝復(fù)康血清組collagenⅠ，a-SMA,β-catenin,Wnt1,Frizzled1,Frizzled2,MKK4,MKK7,JNK1在基

8、因水平表達(dá)均有明顯的下降(P＜0.05)，XAV9391umol/L，2umol/L組collagen，a-SMA，β-catenin，Wnt1，F(xiàn)rizzled1在基因水平均有明顯下降(P＜0.05)，其下降程度與肝復(fù)康藥物血清組無顯著性差別。XAV9391umol/L，2umol/L組Frizzled2，MKK4，MKK7，JNK1的表達(dá)與正常血清組比較無明顯差別，但與肝復(fù)康藥物血清組比較差別顯著。
　　 3.Western

9、-blot法結(jié)果:與正常血清組相比肝復(fù)康血清組β-catenin和p-JNK表達(dá)顯著下降(P＜0.05)，XAV9391umol/L，2umol/L組β-catenin表達(dá)也顯著下降(P＜0.05)，與肝復(fù)康組相比無顯著性差別，而p-JNK表達(dá)則不明顯。
　　 結(jié)論:
　　 1.在HSC-T6細(xì)胞活化過程中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路相對(duì)于Wnt/JNK信號(hào)通路起主要作用。
　　 2.肝復(fù)康對(duì)Wnt/β-