RNA干擾對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞COL1A1基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的： 肝纖維化(hepatic fibrosis)是肝硬化前期的病理過(guò)程，可由多種原因引起，在我國(guó)主要是乙型病毒性肝炎，酒精性肝纖維化作為其病因近年也呈上升趨勢(shì)，目前對(duì)于肝纖維化的防治尚無(wú)確切有效的手段。肝纖維化的主要病理過(guò)程是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellmatrim，ECM)沉積，而Ⅰ型膠原是ECM的主要成分，正常肝臟膠原蛋白占總蛋白5-10％，其中Ⅰ型膠原蛋白占總膠原蛋白的40-50％，Ⅲ型膠原蛋白占總膠原蛋白的40-5

2、0％，肝纖維化時(shí)膠原蛋白可占總蛋白的50％甚至更多，其中Ⅰ型膠原蛋白占總膠原蛋白的比例升至60-70％，Ⅲ型膠原蛋白降至20-30％。可見(jiàn)肝纖維化時(shí)主要是肝臟中I型膠原過(guò)度增加的結(jié)果?，F(xiàn)已證明，肝纖維化是一種可逆的病理過(guò)程，因此本研究設(shè)計(jì)針對(duì)大鼠前Ⅰ型膠原α1鏈(COL1A1)基因的siRNA并構(gòu)建重組質(zhì)粒，同時(shí)檢測(cè)其對(duì)Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的抑制效果，為肝纖維化的基因治療提供新的靶標(biāo)。 實(shí)驗(yàn)材料與方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料 真核表

3、達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo、E.coliDH5α、質(zhì)粒抽提試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHI、BbsI、PstI、T4連接酶、Taq酶、Lipofectamine2000、G418、COLIA1兔多克隆抗體、β-actin兔抗人多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗、大鼠肝星狀T6細(xì)胞。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、篩選siRNA序列和構(gòu)建重組質(zhì)粒從NCBI網(wǎng)站獲得大鼠的COL1A1cDNA序列，設(shè)計(jì)3個(gè)針對(duì)COL1A1基因不同位點(diǎn)

4、的siRNA序列，合成雙鏈DNA(double-strandedDNA)連接到帶有U6啟動(dòng)子的pGPU6/GFP/Neo載體上，分別命名為pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C。 2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染 通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6細(xì)胞中。經(jīng)G418進(jìn)行穩(wěn)定篩選，2周后選擇單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。 3、檢

5、測(cè)抑制效果采用蛋白印跡(Westemblotting)方法檢測(cè)I型膠原蛋白表達(dá)情況。 4、統(tǒng)計(jì)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以-x±s表示，采用SPSS13.0軟件分析數(shù)據(jù)，組間比較采用多組單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、選擇的針對(duì)COL1A1基因的siRNA序列COL1A1-A:5'-GAGTATGGAAGCGAAGGTTCC-3'，3'-CTCATACCTTCGCTTC

6、CAAGG-5'；COL1A1-B:5'-ACAAGGTGACAGAGGCATAAA-3'，3'-TGTTCCACTGTCTCCGTAITT-5'；COL1A1-C:5'-TGATGGITCTCCTGGCAAAGA-3'，3'-ACTACCAAGAGGACCGTTTCT-5'。 2、重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI、Pst1分別單酶切后，陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果證實(shí)靶向COL1A1mRNA的3個(gè)重組質(zhì)粒的shRNA序列與設(shè)計(jì)的完全一致，構(gòu)