CHO-hTSHR細(xì)胞株的構(gòu)建及其初步應(yīng)用研究.pdf

1、目的：⑴構(gòu)建CHO-hTSHR細(xì)胞株。⑵研究轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞的hTSHR的功能及CHO-hTSHR細(xì)胞株在檢測(cè)Graves病（GD）患者血清中TSAb方面的初步應(yīng)用價(jià)值。 方法：①將本課題組前期所構(gòu)建的pcDNA3.1-hTSHR中hTSHR cDNA的全部序列進(jìn)行測(cè)定，并采用環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)對(duì)發(fā)生突變的堿基進(jìn)行定點(diǎn)誘變。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將序列完全正確的pcDNA3.1-hTSHR轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞，通過G418篩選及有限稀釋法挑

2、選出單克隆陽性細(xì)胞株。提取轉(zhuǎn)染hTSHR的CHO細(xì)胞基因組DNA，PCR擴(kuò)增目的條帶，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。采用RT-PCR法、免疫細(xì)胞化學(xué)染色法及Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞的hTSHR基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)情況。②采用受體的放射配體結(jié)合分析法，以固定量125I-bTSH及濃度遞增的未標(biāo)記bTSH與CHO-hTSHR細(xì)胞膜上的hTSHR發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)來分析受體的基本功能。通過濃度遞增的bTSH溶液刺激CHO-hTSH

3、R細(xì)胞并測(cè)定cAMP的產(chǎn)量來評(píng)價(jià)hTSHR的生物學(xué)活性。采用正常對(duì)照組及GD甲亢組血清的粗提IgG溶液刺激CHO-hTSHR細(xì)胞并測(cè)定cAMP的產(chǎn)量，計(jì)算TSAb活性。以正常對(duì)照組TSAb活性的+2s作為正常上限值，根據(jù)該陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)來計(jì)算GD甲亢組TSAb的陽性檢出率。 結(jié)果：⑴經(jīng)測(cè)序后發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒中hTSHR cDNA的第259位堿基由G突變?yōu)镃，故采用環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)成功將其誘變回正常的堿基。成功將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞

4、并挑選出單克隆陽性細(xì)胞株。通過PCR及RT-PCR法均擴(kuò)增出特異性片段，大小與預(yù)期相符，且序列完全正確。免疫細(xì)胞化學(xué)染色后在光鏡下可見轉(zhuǎn)染hTSHR的CHO細(xì)胞有棕黃色著色。Western blot法中觀察到特異性條帶，相對(duì)分子量與預(yù)期基本相符。⑵競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)表明：隨著bTSH濃度的遞增，125I-bTSH與hTSHR結(jié)合的量逐漸下降。bTSH刺激試驗(yàn)顯示：隨著bTSH濃度的遞增，細(xì)胞cAMP產(chǎn)量亦逐漸升高，當(dāng)bTSH濃度為10mIU/