hTSHR體外轉(zhuǎn)染失分化型甲狀腺癌細(xì)胞株后再分化相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文對(duì)hTSHR體外轉(zhuǎn)染失分化型甲狀腺癌細(xì)胞株后再分化的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。本研究分為兩個(gè)部分：
　　 目的：通過(guò)重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/hTSHR 體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染失分化型濾泡狀甲狀腺癌細(xì)胞株（FTC-133 亞型，sFTC-133）后，觀察轉(zhuǎn)染人的促甲狀腺激素受體（human thyrotropin receptor，hTSHR）的細(xì)胞攝碘能力及分化相關(guān)基因mRNA的變化水平，以明確TSHR 對(duì)失分化型甲狀腺癌細(xì)胞

2、株再分化的作用和意義。
　　 方法：重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/hTSHR 轉(zhuǎn)化DH5а 感受態(tài)菌，進(jìn)行擴(kuò)增，酶切，及核苷酸測(cè)序方法鑒定。體外轉(zhuǎn)染重組pcDNA3.1/hTSHR 質(zhì)粒，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)TSHR 的表達(dá)產(chǎn)物， 125I 攝碘實(shí)驗(yàn)檢測(cè)攝碘能力，相對(duì)定量實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)（Realtime-PCR）來(lái)檢測(cè)TSHR、鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體（NIS）、甲狀腺過(guò)氧化物酶（TPO）、甲狀腺球蛋白(Tg) mRNA 相對(duì)含量。統(tǒng)計(jì)

3、學(xué)檢驗(yàn)方法采用SPSS 13.0軟件，計(jì)量資料采用t 檢驗(yàn)，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：pcDNA3.1/hTSHR 經(jīng)PCR 擴(kuò)增 hTSHR-cDNA 片段約113kb，Kpn I 和XbaI 雙酶切后：hTSHR-cDNA 的片段約2.3 kb，pcDNA3.1(+)的片段約5.5 kb，均同預(yù)期片段大小相符；核苷酸測(cè)序方法鑒定測(cè)序結(jié)果與GenBank 中收錄的hTSHR全長(zhǎng)序列一致，表明真核表達(dá)質(zhì)粒

4、構(gòu)建正確。在hTSHR 刺激下，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/hTSHR 的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)的細(xì)胞比較：①免疫熒光檢測(cè)在甲狀腺腫瘤細(xì)胞胞漿、胞膜有增強(qiáng)的綠色熒光，②125I 攝取率是對(duì)照組的2.9 倍（t=28.63，P<0.01），③甲狀腺碘攝取相關(guān)基因TSHR、NIS、TPO、Tg mRNA的表達(dá)分別升高1.7 倍(t=13.8, p<0.05)，4 倍(t=28.52, p<0.05)，1.5 倍(t=14.43,p<0.

5、05)，2.2 倍(t=19.83，p<0.05)。
　　 結(jié)論：重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/hTSHR 體外轉(zhuǎn)染甲狀腺癌腫瘤細(xì)胞后，可有效提高碘的攝取及分化相關(guān)基因的表達(dá)，為失分化甲狀腺癌放射性碘治療提供了一個(gè)新的依據(jù)。
　　 第二部分：
　　 目的：構(gòu)建hTSHR 基因的的重組慢病毒表達(dá)載體，并感染失分化型濾泡狀甲狀腺癌細(xì)胞株（FTC-133 亞型，sFTC-133），觀察hTSHR 的表達(dá)，并構(gòu)建穩(wěn)定

6、表達(dá)hTSHR 的sFTC-133 細(xì)胞。
　　 方法：運(yùn)用巢式PCR 技術(shù)對(duì)重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/hTSHR 中突變位點(diǎn)C進(jìn)行誘變回正常的序列G，經(jīng)PCR 擴(kuò)增反應(yīng)獲得hTSHR 基因，并將其連接到含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因的慢病毒表達(dá)載pGC-FU 中，重組獲得慢病毒質(zhì)粒pGC-FU-hTSHR，經(jīng)PCR 擴(kuò)增反應(yīng)和DNA 測(cè)序方法鑒定重組體，鑒定正確的重組體將其與輔助包裝質(zhì)粒（pHelper 1.0

7、 載體，pHelper 2.0 載體）一起共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，包裝生產(chǎn)病毒并測(cè)定病毒滴度。所獲慢病毒感染失分化型甲狀腺癌細(xì)胞株后，采用熒光顯微鏡的方法檢測(cè)hTSHR 的表達(dá)。
　　 結(jié)果：PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)證實(shí)hTSHR 基因已定向連入慢病毒表達(dá)載pGC-FU 目的載體，DNA 測(cè)序結(jié)果顯示，所構(gòu)建的pGC-FU-hTSHR 重組慢病毒質(zhì)粒序列與目標(biāo)序列完全一致, 表明重組質(zhì)粒pGC-FU-hTSHR 已構(gòu)建成功，且獲得的病毒滴度