周期素依賴性蛋白激酶亞單位1(Cks1)在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義.pdf

1、研究目的:
　　 人腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，目前的治療仍以傳統(tǒng)的手術(shù)切除聯(lián)合放療和化療，由于腫瘤的高度增殖及惡性侵襲而無(wú)法徹底治愈?；蛑委熓墙鼇?lái)新興的膠質(zhì)瘤治療手段，通過(guò)研究膠質(zhì)瘤的特異性蛋白及基因，運(yùn)用靶向方法，來(lái)達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)甚至消除腫瘤的目的，但該治療目前尚處于探索階段。尋找能調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的分子靶點(diǎn)并探索其在膠質(zhì)瘤發(fā)病過(guò)程中的可能作用機(jī)制，已成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。本研究通過(guò)

2、檢測(cè)周期素依賴性蛋白激酶亞單位1（cyclin kinase subunit1，Cks1）在人腦膠質(zhì)瘤及正常腦組織中的表達(dá)差異，并結(jié)合患者臨床病理學(xué)及隨訪資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，初步探討Cks1表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別、生存預(yù)后的關(guān)系;進(jìn)一步通過(guò)過(guò)表達(dá)Cks1慢病毒載體構(gòu)建，檢測(cè)Cks1過(guò)表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的細(xì)胞周期的影響，從而探討Cks1在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展生物學(xué)過(guò)程中的可能作用，或?yàn)槟z質(zhì)瘤臨床治療提供新的分子靶標(biāo)。
　　 研究方法:

3、r>　　 運(yùn)用免疫組織化學(xué)EnVision法及蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cks1，Skp2，p27在腦膠質(zhì)瘤組織切片及正常腦組織切片中的蛋白表達(dá)水平，對(duì)樣本患者進(jìn)行臨床病例資料的隨訪，結(jié)合患者病理學(xué)特征運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。運(yùn)用PCR等技術(shù)構(gòu)建Cks1過(guò)表達(dá)慢病毒載體LV5(EF1-GFP/Puro)，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cks1的表達(dá)量并通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)分析Cks1過(guò)表達(dá)后膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172細(xì)胞周期的影響，初步探討Cks1在腦膠質(zhì)

4、瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的功能角色。
　　 結(jié)果:
　　 免疫組織化學(xué)EnVision法顯示Cks1蛋白主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核。在正常腦組織中幾乎全部有表達(dá)，其陽(yáng)性染色的細(xì)胞百分率為58.54±15.66％，在低級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHOⅠ～Ⅱ級(jí)）和高級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHOⅢ～Ⅳ級(jí)）中的陽(yáng)性染色的細(xì)胞百分率分別為31.25±27.50％和19.62±18.75％，隨著病理級(jí)別增高而有降低趨勢(shì)，三者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。Skp2

5、、p27蛋白主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核。在正常腦組織中Skp2全部無(wú)表達(dá)，低級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHOⅠ～Ⅱ級(jí)）和高級(jí)別膠質(zhì)瘤(WHOⅢ～Ⅳ級(jí))中陽(yáng)性染色的細(xì)胞百分率分別為6.97±5.50％和17.51±17.68％，隨著病理級(jí)別增高而有增高趨勢(shì)，三者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。在正常腦組織中p27表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，正常腦組織、低級(jí)別膠質(zhì)瘤(WHOⅠ～Ⅱ級(jí))和高級(jí)別膠質(zhì)瘤(WHOⅢ～Ⅳ級(jí))中陽(yáng)性染色的細(xì)胞百分率分別為85.50±7.17％、51

6、.11±19.87％和23.78±17.53％，隨著病理級(jí)別增高而有下降趨勢(shì)，三者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)顯示Cks1在正常腦組織，低級(jí)別膠質(zhì)瘤和高級(jí)別膠質(zhì)瘤中的蛋白印跡實(shí)驗(yàn)條帶光密度相對(duì)值分別為6.43±1.03、3.61±1.45、1.21±0.87，三者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。在三個(gè)蛋白兩兩比較中，統(tǒng)計(jì)分析提示僅Cks1與p27表達(dá)之間呈正相關(guān)(r=0.38，p＜0.05)，Cks1和Skp2表

7、達(dá)之間無(wú)相關(guān)性(r=0.08，p＞0.05)，p27和Skp2之間無(wú)相關(guān)性(r=-0.16，p＞0.05)。在評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤預(yù)后的影響因素時(shí)，Cox回歸單因素分析提示低腫瘤級(jí)別、全切除率、低Skp2和高p27表達(dá)對(duì)生存預(yù)后有利(p＜0.05)，Cks1表達(dá)水平對(duì)膠質(zhì)瘤患者生存時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。進(jìn)一步在高級(jí)別膠質(zhì)瘤亞組中對(duì)臨床有意義指標(biāo)年齡、切除率、Cks1和Skp2表達(dá)水平運(yùn)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析，結(jié)果提示年齡＜55

8、歲、全切除及Cks1高表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者有更好的預(yù)后(p＜0.05)。通過(guò)PCR等技術(shù)成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)Cks1慢病毒載體LV5(EF1-GFP/Puro)，轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172后蛋白印跡實(shí)驗(yàn)提示Cks1表達(dá)量較母細(xì)胞系增高(5.77±0.92 vs2.46±0.12，p＜0.05)。經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)分析提示過(guò)表達(dá)Cks1后腫瘤細(xì)胞時(shí)相變化主要集中在G2/M期，與無(wú)目的基因Cks1的干擾組細(xì)胞系比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（38.13±0.72 v