雙重?zé)晒舛縍T-PCR法檢測(cè)柯薩奇病毒A2-A5型或A6-A10型技術(shù)的建立與應(yīng)用.pdf

1、手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是由人類(lèi)腸道病毒(humanenterovirus，HEV)引起的一類(lèi)兒童常見(jiàn)傳染病。人類(lèi)腸道病毒目前共有90多種基因型，分為A、B、C、D共4個(gè)組，其中最主要的病原體是HEV-A組中的腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A16型(Coxsackie virus A16，CVA16)。但越來(lái)越多的研究表明，HEV中的一些其他血清型，如CVA2、CVA5、CVA

2、6、CVA10型等也是引起HFMD的常見(jiàn)病原。當(dāng)前，許多國(guó)家和地區(qū)爆發(fā)了以CVA2、CVA5、CVA6、CVA10型為主的手足口病，而浙江省卻沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道。CVA2、CVA5、CVA6、CVA10型這四種病原體檢測(cè)也沒(méi)有相對(duì)及時(shí)、高效、準(zhǔn)確、便捷的檢測(cè)試劑盒。我國(guó)的HFMD病原診斷市場(chǎng)，仍然以檢測(cè)腸道病毒通用型或EV71型和CVA16型為主，導(dǎo)致HFMD病原體檢測(cè)不明確或漏檢等，造成患者治療的延誤及診斷試劑的浪費(fèi)等。因而開(kāi)發(fā)一種針對(duì)C

3、VA2、CVA5、CVA6、CVA10型病原檢測(cè)的診斷試劑迫在眉睫。為了快速準(zhǔn)確鑒別診斷由CVA2、CVA5、CVA6、CVA10型引起的HFMD，本研究擬采用RT-PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)CVA2/CVA5型或CVA6/CVA10型四種亞型，并通過(guò)建立的此方法進(jìn)行臨床應(yīng)用。
　　第一部分 雙重?zé)晒舛縍T-PCR法檢測(cè)柯薩奇病毒A2/A5型或柯薩奇病毒A6/A10型方法的建立
　　方法:
　　1.從美國(guó)NCBI基因庫(kù)下載了

4、涵蓋國(guó)內(nèi)外CVA2、CVA5、CVA6、CVA10型的多條基因序列。利用DNAman軟件對(duì)其進(jìn)行了同源性比較，確定以上病毒基因組的保守區(qū)。使用Primer Express3.0軟件在其保守區(qū)設(shè)計(jì)高度特異性的引物與TaqMan探針，引物和探針序列均通過(guò)Blast驗(yàn)證，并對(duì)兩對(duì)引物及探針濃度進(jìn)行優(yōu)化。
　　2.通過(guò)優(yōu)化后反應(yīng)體系，利用CVA2、CVA5、CVA6、CVA10型核酸片段和EV71型、CVA16型、CVB1型、CVB3型、

5、?？瞬《?0型，及甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒的陽(yáng)性核酸等分離株評(píng)價(jià)該法的特異性，對(duì)已標(biāo)定拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋?zhuān)叫羞M(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)，比較其靈敏度。分別取CVA2型、CVA5型、CVA6型、CVA10型合成片段（終濃度均為106copies/ml）按10倍梯度稀釋成4個(gè)不同的濃度，對(duì)每一個(gè)濃度的陽(yáng)性核酸稀釋液作6次重復(fù)檢測(cè)，得到的CT值計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，驗(yàn)證該方法的重復(fù)性。
　　結(jié)果:
　　1.

6、通過(guò)優(yōu)化引物探針組合濃度，雙重?zé)晒釸T-PCR結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所選的引物和探針檢測(cè)CVA2、CVA5型與CVA6型、CVA10型、EV71型、CVA16型、CVB1型、CVB3型、?？瞬《?0型，及甲型流感病毒、呼吸遒合胞病毒、博卡病毒的陽(yáng)性核酸均無(wú)交叉反應(yīng)，具有高度的特異性。該方法具有較高靈敏度，其最低檢測(cè)限達(dá)到102copies/mL。對(duì)每一個(gè)濃度的樣本作6個(gè)重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果不同核酸濃度各自的檢測(cè)Ct值標(biāo)準(zhǔn)差在0.13～0.28之間，批

7、內(nèi)變異系數(shù)(CV)均＜1.33％，并具有較好的重復(fù)性。
　　2.通過(guò)優(yōu)化引物探針組合濃度，雙重?zé)晒釸T-PCR結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所選的引物和探針檢測(cè)CVA6、CVA10型與CVA2型、CVA5型、EV71型、CVA16型、CVB1型、CVB3型、?？瞬《?0型，及甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒的陽(yáng)性核酸均無(wú)交叉反應(yīng)，具有高度的特異性。該方法具有較高靈敏度，其最低檢測(cè)限達(dá)到102 copies/mL，對(duì)每一個(gè)濃度的樣本作6個(gè)重復(fù)

8、檢測(cè)，結(jié)果不同核酸濃度各自的檢測(cè)Ct值標(biāo)準(zhǔn)差在0.14～0.28之間，批內(nèi)變異系數(shù)(CV)均＜1.44％，并具有較好的重復(fù)性。
　　結(jié)論:
　　成功建立了單管中能同時(shí)檢測(cè)并鑒別CVA2、CVA5型雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法與單管中能同時(shí)檢測(cè)并鑒別CVA6、CVA10型雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法全封閉單管擴(kuò)增、簡(jiǎn)便快捷、重復(fù)性好、實(shí)時(shí)定量、污染少等優(yōu)勢(shì)，克服了以往臨床診斷的缺陷，具有高度的特異性

9、和敏感性，為臨床診斷提供了準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，可作為一種臨床病原診斷的有效、快速的檢測(cè)手段。
　　第二部分 雙重?zé)晒舛縍T-PCR法檢測(cè)柯薩奇病毒A2/A5型或柯薩奇病毒A6/A10型方法的臨床應(yīng)用
　　方法:
　　用建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR法分別對(duì)2013年3月至2013年6月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院以及杭州市兒童醫(yī)院和湖州市中心醫(yī)院的手足口病患者及疑似患者糞便標(biāo)本總共367份進(jìn)行CVA2、CVA5型病原

10、體檢測(cè)和2013年3月至2013年9月間浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院以及杭州市兒童醫(yī)院和湖州市中心醫(yī)院的手足口病患者及疑似患者糞便標(biāo)本總共419份進(jìn)行CVA6、CVA10型病原體檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。隨機(jī)選擇10株CVA2、CVA5陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，然后測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI BLAST程序與Gen Bank中的病毒核苷酸序列比對(duì)，確定病毒型別。用MEGA4.0進(jìn)行序列和進(jìn)化分析，用Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算毒株間的遺傳距離，用N

11、J法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù);用Vector NTI AlignX程序計(jì)算毒株序列同源性。
　　結(jié)果:
　　采用本方法中的熒光定量RT-PCR法對(duì)收集到的標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果如下:收集的367份大便標(biāo)本中，CVA2型陽(yáng)性23份，陽(yáng)性率6.3％;CVA5型陽(yáng)性11份，陽(yáng)性率3.0％。收集的419份大便標(biāo)本中，CVA6型陽(yáng)性171份，陽(yáng)性率40.8％;CVA10型陽(yáng)性27份，陽(yáng)性率6.4％。檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全相符。測(cè)序的CVA2株、

12、CVA5株VP1區(qū)核苷酸序列均具有高度的一致性，與周邊國(guó)家或地區(qū)CVA2的核苷酸同源性為92.3％～99％，CVA5核苷酸同源性為92％～97.8％。在2012年至2013年間以CVA2、CVA5、CVA6、CVA10引起的手足口病，病原體呈大流行趨勢(shì)，親緣關(guān)系較近沒(méi)有隨遷徙而變異。
　　結(jié)論:
　　該檢測(cè)方法能對(duì)CVA2、CVA5型與CVA6、CVA10型進(jìn)行病原體檢測(cè)，并提供病原體滴度，從而減少了病原體不明確或漏檢，及診