基于ITS-1弓形蟲(chóng)基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)技術(shù)的研究及應(yīng)用.pdf

1、弓形蟲(chóng)是一種呈世界性分布的機(jī)會(huì)性致病原蟲(chóng)，可以寄生于包括人在內(nèi)的幾乎所有溫血?jiǎng)游锏挠泻思?xì)胞內(nèi)。由其引起的弓形蟲(chóng)病，對(duì)動(dòng)物以及人類(lèi)危害較嚴(yán)重。免疫系統(tǒng)正常的人感染弓形蟲(chóng)病后，呈隱性感染狀態(tài)，通常不會(huì)呈現(xiàn)明顯的臨床癥狀;免疫力低下的人群（如艾滋病患者、骨髓移植和器官移植病人等）感染該病后，會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的病變，甚至?xí)鹚劳?。妊娠期母畜感染該病，常可引起流產(chǎn)、死胎、以及胎兒眼部、大腦和中樞神經(jīng)損傷，會(huì)對(duì)畜牧業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前針對(duì)弓形蟲(chóng)的

2、檢測(cè)技術(shù)，存在著操作復(fù)雜、敏感性低，假陽(yáng)性率高，需要昂貴的儀器設(shè)備等缺點(diǎn)，而基層單位迫切需要一種既有良好的特異性和敏感性，又簡(jiǎn)便實(shí)用的檢測(cè)方法。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)迅速、靈敏性和特異性高等優(yōu)點(diǎn)，能滿足目前的這種迫切需求。
　　本研究基于弓形蟲(chóng)RH株的核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因1(ITS-1)序列，設(shè)計(jì)特異性引物，建立了針對(duì)弓形蟲(chóng)的普通PCR檢測(cè)方法。該普通PCR檢測(cè)體系特異性強(qiáng)，不能在犬新孢子蟲(chóng)、棘球

3、蚴、旋毛蟲(chóng)、李斯特桿菌、豬鏈球菌基因組DNA中擴(kuò)增出條帶;敏感性高，該方法可檢測(cè)到的弓形蟲(chóng)DNA最低量為90fg/μL。
　　同時(shí)基于弓形蟲(chóng)RH株的ITS-1基因序列，設(shè)計(jì)6條特異性識(shí)別靶序列上8個(gè)區(qū)域的引物，經(jīng)過(guò)LAMP擴(kuò)增和體系優(yōu)化，建立檢測(cè)弓形蟲(chóng)的LAMP方法。該LAMP方法在65℃恒溫條件下，經(jīng)過(guò)30 min擴(kuò)增即可完成反應(yīng)。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法與犬新孢子蟲(chóng)、棘球蚴、旋毛蟲(chóng)、李斯特桿菌、豬鏈球菌等病原體的基因組DNA

4、不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，其最低能檢測(cè)到的弓形蟲(chóng)DNA量為0.9 fg/μL，與前面建立的普通PCR檢測(cè)方法相比，該LAMP檢測(cè)方法的敏感性要高100倍。該檢測(cè)體系的成功建立為獸醫(yī)基層單位提供弓形蟲(chóng)病的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查的技術(shù)支持。
　　為了解浙江省杭州、金華地區(qū)豬中弓形蟲(chóng)病的流行現(xiàn)狀，更好地為弓形蟲(chóng)病的防治及豬肉食品衛(wèi)生安全的保障提供科學(xué)的依據(jù)，我們從浙江省杭州、金華地區(qū)屠宰場(chǎng)采集118份豬肉膈肌樣本，應(yīng)用建立的

5、普通PCR和LAMP檢測(cè)體系對(duì)采集的118份膈肌樣本進(jìn)行檢測(cè)。調(diào)查結(jié)果顯示上述地區(qū)豬肉中弓形蟲(chóng)陽(yáng)性率較高，其中LAMP檢測(cè)方法檢出16份陽(yáng)性樣本，陽(yáng)性率為13.56％;普通PCR方法檢出11份陽(yáng)性樣本，陽(yáng)性率為9.32％。鑒于目前尚無(wú)十分有效的弓形蟲(chóng)疫苗可以預(yù)防該病，因此制定合理的防控方案對(duì)于上述地區(qū)的弓形蟲(chóng)病預(yù)防方面具有重要意義。對(duì)豬肉樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示豬肉中弓形蟲(chóng)陽(yáng)性率與飼養(yǎng)管理方式相關(guān)，不同地區(qū)陽(yáng)性率之間差異顯