環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術(shù)檢測海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的研究.pdf

1、背景:
　　副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種廣泛分布于海產(chǎn)品和咸水環(huán)境中的革蘭氏陰性菌，可導致胃腸道炎癥，還能引發(fā)危及生命的敗血癥。國內(nèi)外發(fā)布的法規(guī)和標準都明確規(guī)定，在眾多食品的檢測中都要求不得檢出，目前的主要檢測方法是《GB4789.7-2013食品安全國家標準食品微生物學檢驗副溶血性弧菌檢驗》，檢驗程序包括前增菌-選擇性增菌-選擇性平板分離-生物化學篩選-血清學鑒定等步驟，通常需要5～7天才

2、能完成檢測，操作繁瑣。除傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法外，《SN/T2424-2010進出口食品中副溶血性弧菌快速及鑒定檢測方法實時熒光PCR法》采用實時熒光PCR方法，通過增菌-核酸提取-熒光PCR檢測步驟，操作相對簡便、檢測周期相對較短，但需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員，較難滿足市場需求。環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification，簡稱LAMP）是一種新式核酸等溫擴增技術(shù)，由日本的Notomi

3、等研發(fā)，具有簡單、快速、特異性強的特點，其原理是針對靶基因的特定區(qū)域設(shè)計特異性引物，在具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)作用下，能在等溫條件下實現(xiàn)靶基因的一步擴增，引入環(huán)引物后，擴增效率還可大大增加。
　　目的:
　　1.針對副溶血性弧菌的特異性基因—tlh基因設(shè)計不同引物并對引物進行篩選，對反應(yīng)體系進行優(yōu)化，建立針對副溶血性弧菌的特異性強、靈敏度高、重現(xiàn)性好的LAMP方法。
　　2.

4、以優(yōu)化后的LAMP方法為基礎(chǔ)，建立針對海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的方便快速、特異性強、靈敏度高的LAMP檢測系統(tǒng)。
　　方法:
　　1.針對副溶血性弧菌的不耐熱溶血毒素(thermolabile hemolysin，TLH)tlh基因，設(shè)計2套引物并篩選出出峰時間早、檢測信號強、無非特異性擴增的引物序列，在反應(yīng)體系中加入SYTO-9熒光染料，60～65℃的恒溫條件下保溫30～60min，即可完成靶序列的特異性擴增，通過儀器可實時監(jiān)

5、測反應(yīng)結(jié)果。對建立的LAMP方法從Mg2+濃度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度和反應(yīng)溫度4個變量參數(shù)進行優(yōu)化，并對方法的特異性、靈敏度、重現(xiàn)性進行評價。
　　2.建立完整的LAMP檢測系統(tǒng)——包括優(yōu)化后的LAMP方法和根據(jù)本方法研制的副溶血性弧菌核酸檢測試劑盒以及Deaou-308℃恒溫熒光檢測儀，利用該檢測系統(tǒng)對1株副溶血性弧菌標準菌株、50株副溶血性弧菌野生菌株、8株副溶血性弧菌近源菌株以及40份加標海產(chǎn)品樣品（包括加工海鮮食品、

6、魚類、貝類等樣品）進行檢測，評價LAMP檢測系統(tǒng)的特異性和靈敏度。
　　結(jié)果:
　　1.建立并優(yōu)化的LAMP檢測方法反應(yīng)體系為:內(nèi)引物(FIP、BIP)各1.6μmol/L，外引物(F3、B3)各0.2μmol/L，環(huán)引物(LF、LB)各0.8μmol/L，6mmol/LMg2+，8UBst大片斷DNA聚合酶，1.6mmol/LdNTP，0.2μmol/LSYTO-9，DNA模板200ng，反應(yīng)溫度:63℃，反應(yīng)時間:45m

7、in。
　　2.特異性實驗結(jié)果顯示，本方法對副溶血性弧菌檢測結(jié)果均為陽性;對6株副溶血性弧菌近源菌株、14株常見的其他致病菌株檢測結(jié)果均為陰性，方法特異性良好。
　　3.靈敏度實驗結(jié)果顯示，本方法對副溶血性弧菌純培養(yǎng)物的靈敏度為103CFU/mL，副溶血性弧菌質(zhì)粒DNA靈敏度可達1fg/μl。
　　4.重現(xiàn)性實驗結(jié)果顯示，本方法對副溶血性弧菌質(zhì)粒DNA檢出限以上濃度重復(fù)20次檢測結(jié)果均為陽性，對陰性樣品重復(fù)20次檢測結(jié)

8、果均為陰性，重現(xiàn)性良好。
　　5.LAMP檢測系統(tǒng)（包括優(yōu)化后的LAMP方法和根據(jù)本方法研制的副溶血性弧菌核酸檢測試劑盒以及Deaou-308℃恒溫熒光檢測儀）的特異性實驗結(jié)果顯示，對1株副溶血性弧菌標準菌株和50株副溶血性弧菌野生菌株檢測結(jié)果均為陽性，對8株副溶血性弧菌近源菌株檢測結(jié)果均為陰性，特異性良好。
　　6.LAMP檢測系統(tǒng)的靈敏度實驗結(jié)果顯示，對40份加標海產(chǎn)品樣品（包括加工海鮮食品、魚類、貝類等樣品）的檢測靈敏

9、度均可達到103CFU/mL。
　　結(jié)論:
　　1.針對副溶血性弧菌的tlh基因建立并優(yōu)化的LAMP快速檢測方法具有方便快速、特異性強、靈敏度高、重現(xiàn)性好的優(yōu)點，為副溶血性弧菌的快速檢測提供了新的發(fā)展方向。
　　2.建立了海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的LAMP檢測系統(tǒng)（包括優(yōu)化后的LAMP方法、副溶血性弧菌核酸檢測試劑盒以及Deaou-308℃恒溫熒光檢測儀），該檢測系統(tǒng)方便快速、特異性強、靈敏度高，適用于海產(chǎn)品中副溶血性弧菌