轉(zhuǎn)雙價抗蟲基因棉花的獲得、檢測和基因表達研究.pdf

1、y7 8 3 5 2 9四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩i - 學(xué)位論文轉(zhuǎn)雙價抗蟲基因棉花的獲得、檢測和基因表達研究孫善君指導(dǎo)教師至垡重墼塑! 四』l l 墨些盔堂!鹽墼三型塑旦! 主國盟堂墮焦塑嬰基廈!學(xué)科專業(yè) 堡塑壟焦量亙壁研究方向 植物基因工程與育種2 0 0 5 年5 月四川農(nóng)業(yè)大學(xué)中；國科學(xué)院植物研究所摘 要棉花的生產(chǎn)周期長，蟲害損失大，常年達1 0 —1 6 ％，災(zāi)害年份可達3 0 ％。防治蟲害長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥不但增加了棉花生產(chǎn)成本，還易

2、引起害蟲抗藥性增強、環(huán)境污染、生態(tài)平衡破壞等一系列嚴(yán)重問題。轉(zhuǎn)基因改良棉花可以將抗蟲基因分離克隆導(dǎo)入棉花而增強棉花自身的抗蟲性，從而可以節(jié)省生產(chǎn)成本，保護環(huán)境。目前在植物抗蟲基因工程中常見的外源抗蟲基因有蘇云金芽孢桿菌( 口t ) 殺蟲蛋白基因、蛋白酶抑制劑( 仃) 基因、淀粉酶抑制劑( 彳，) 基因、外源凝集素基因、脂肪氧化酶基因以及蝎毒素、蜘蛛毒素基因等。其中蘇云金芽孢桿菌( 所) 殺蟲蛋白基因、蛋白酶抑制劑( Ⅳ) 基因和外源凝集

3、素基因在棉花抗蟲基因工程中應(yīng)用最多。本實驗利用花粉管通道方法將蘇云金芽孢桿菌( 口t ) 殺蟲蛋白基因和雪花蓮?fù)庠茨? g n a ) 基因轉(zhuǎn)化到棉花中，提高棉花對鱗翅目害蟲的抗性和對桃蚜的耐性。以棉花品系S N 為材料，將p B S G S l M 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體大腸桿菌D H 5 n 中，擴增后提取質(zhì)粒D N A ，待棉花盛花期時，利用花粉管通道轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒D N A 注射到授粉2 0 h 左右的子房中。將收獲的種子浸泡萌發(fā)后植于

4、溫室，經(jīng)過田間卡那霉素篩選，獲得了1 2 株轉(zhuǎn)基因植株。P C R 、S o u t h e r n b l o t t i n g 檢測結(jié)果表明，B t 和g n a 基因已經(jīng)整合到棉花基因組中。對轉(zhuǎn)化植株進行蟲試的結(jié)果表明，受試植株上的棉鈴蟲在5 d 內(nèi)的校正死亡率超過了8 0 ％，而且存活幼蟲的生長發(fā)育受到明顯的抑制；轉(zhuǎn)化植株具有較強的抗蚜活性，平均能夠抑制桃蚜6 0 ％以上的蚜口密度，最高的高達7 0 ％。結(jié)果表明，利用改造的抗

5、蟲基因轉(zhuǎn)化棉花植株已獲得既抗蟲又耐蚜的轉(zhuǎn)基因的棉花。對轉(zhuǎn)基因棉花的苗期倒3 葉、苗期倒5 葉、現(xiàn)蕾期功能葉、花期功能葉、根、莖皮、鈴皮、鈴內(nèi)容物、花苞片、花瓣進行三明治E L I S A 撿i 貫! l ，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因檀株均有不同程度的耽殺蟲蛋白表達。外源基因在植株各部位或不同的組織器官表達有顯著的差異，其中在現(xiàn)蕾期功能葉達到2 9 2 3 ．7 n g ／g 鮮重。另外，歲} 源基因的表達量存在時間和空間的不同分布。轉(zhuǎn)化用的表達載體