轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲早粳稻品系目的基因整合及其表達(dá).pdf

1、水稻(Oryza sativa)是我國(guó)重要的糧食和經(jīng)濟(jì)作物，也是東北地區(qū)三大主要農(nóng)作物之一。我國(guó)有65％以上的人口以稻米為主食，稻米的生產(chǎn)安全關(guān)乎國(guó)計(jì)民生。現(xiàn)今蟲害對(duì)稻米的生產(chǎn)安全構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，每年水稻因蟲害造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)115億元。傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對(duì)害蟲的防治主要依賴于化學(xué)試劑，但化學(xué)試劑的長(zhǎng)期大量使用不僅浪費(fèi)人力、物力和財(cái)力，還會(huì)造成環(huán)境污染、害蟲再猖獗等問題。因此，培育抗蟲水稻至關(guān)重要。目前，水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)趨于成熟并培育出

2、多種具有抗蟲作用的轉(zhuǎn)Bt基因水稻。
　　本研究以轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲早粳稻空育131和超級(jí)稻松粳9號(hào)為材料，利用常規(guī)PCR、試紙條、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、Southern blot和全基因組重測(cè)序等檢測(cè)方法，從DNA水平、mRNA水平、蛋白水平及Bt基因轉(zhuǎn)錄水平與表達(dá)水平的相關(guān)性進(jìn)行研究，從中選育出外源基因遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)、轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)水平高、拷貝數(shù)低且插入位點(diǎn)未破壞水稻內(nèi)源基因的抗蟲Bt水稻植株。主要結(jié)果如

3、下:
　　1、利用Basta篩選、試紙條和常規(guī)PCR檢測(cè)等方法，經(jīng)過T0～T9代篩選，成功獲得了Bt早粳稻空育131和Bt超級(jí)稻松粳9號(hào)，其中HD1（轉(zhuǎn)cry1C*基因空育131）22個(gè)，HD2（轉(zhuǎn)cry2A*基因空育131）10個(gè)，HD3（轉(zhuǎn)cry1C*基因松粳9號(hào)）45個(gè)，HD4（轉(zhuǎn)cry2A*基因松粳9號(hào)）26個(gè)。
　　2、利用real time PCR方法檢測(cè)Bt水稻分蘗期和抽穗期各組織中Bt基因轉(zhuǎn)錄水平。檢測(cè)結(jié)果表

4、明:同一品系不同株系同一生長(zhǎng)期相同組織間Bt基因轉(zhuǎn)錄水平存在差異;相同株系同一生長(zhǎng)期不同組織間Bt基因轉(zhuǎn)錄水平存在明顯差異，由高到低依次為葉片＞幼穗＞莖鞘;相同株系不同生長(zhǎng)期相同組織間Bt基因轉(zhuǎn)錄水平也存在明顯差異，表現(xiàn)為抽穗期＞分蘗期。
　　3、利用ELISA方法檢測(cè)Bt水稻分蘗期、抽穗期、灌漿期和完熟期各組織中Bt蛋白的表達(dá)量。檢測(cè)結(jié)果表明:同一品系不同株系同一生長(zhǎng)期相同組織間Bt蛋白的表達(dá)量存在差異;相同株系同一生長(zhǎng)期不同組

5、織間Bt蛋白的表達(dá)量存在明顯差異，在分蘗期表現(xiàn)為葉片＞莖鞘，抽穗期表現(xiàn)為葉片＞幼穗＞莖鞘，灌漿期表現(xiàn)為葉片＞莖鞘＞幼穗，且都高于完熟期糙米中Bt蛋白的表達(dá)量;相同株系不同生長(zhǎng)期相同組織間Bt蛋白的表達(dá)量也存在明顯差異，在HD1、HD3品系的葉片和莖鞘中表現(xiàn)為灌漿期＞抽穗期＞分蘗期，在HD2、 HD4品系的葉片和莖鞘中表現(xiàn)為灌漿期≈抽穗期＞分蘗期，在各品系的幼穗中表現(xiàn)為抽穗期≥灌漿期，且都高于完熟期Bt蛋白的表達(dá)量。
　　4、利用S

6、PSS軟件分析Bt水稻中Bt基因轉(zhuǎn)錄水平與翻譯水平相關(guān)性。分析結(jié)果表明:在HD1、HD2、 HD3和HD4品系的葉片、莖鞘和幼穗中Bt基因轉(zhuǎn)錄水平與翻譯水平均在0.01或0.05水平上表現(xiàn)出顯著的正相關(guān)性。
　　5、利用Southern blot檢測(cè)Bt水稻中篩選標(biāo)記基因和目的基因拷貝數(shù)。檢測(cè)結(jié)果表明:經(jīng)過連續(xù)傳代后，篩選標(biāo)記基因和目的基因的遺傳趨于穩(wěn)定，各株系間拷貝數(shù)雖有所不同，但都介于1～2拷貝數(shù)之間。
　　6、利用植物