小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)抗蟲基因的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、在建立了小黑楊花粉植株再生優(yōu)化組培體系:分化培養(yǎng)基為MH+BA0.1 mg/L+NAA0.05mg/L,生根培養(yǎng)基為MH+IBA0.4mg/L的基礎(chǔ)上進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化.確定農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化體系:在上述分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化;葉片預(yù)培養(yǎng)2~3d后,進(jìn)行侵染;工程菌液OD600=0.3~0.5,浸泡時(shí)間為5min,25℃,置暗處共培養(yǎng)2~4d;轉(zhuǎn)入含卡那霉素濃度為40mg/L的選擇培養(yǎng)基上,進(jìn)行選擇培養(yǎng),同時(shí)用濃度

2、700mg/L的頭孢唑林鈉對(duì)葉片進(jìn)行脫菌;得到卡那霉素抗性芽后,在生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)(含有40mg/L卡那霉素,700mg/L頭孢唑林鈉).在建立小黑楊花粉植株遺傳轉(zhuǎn)化體系基礎(chǔ)上,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法向小黑楊植株基因組中導(dǎo)入抗蟲基因(蜘蛛殺蟲肽與Bt基因C末端肽序列連接在一起表達(dá)的一種融合蛋白基因),獲得3個(gè)轉(zhuǎn)化無性系,轉(zhuǎn)化率為0.62﹪,GUS表達(dá)陽性率為75﹪,并對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)檢測和飼蟲試驗(yàn).卡那霉素抗性植株的分子生物學(xué)檢測表

3、明,PCR檢測陽性率均為100﹪,Southern斑點(diǎn)雜交陽性率34﹪,轉(zhuǎn)基因植株目的基因的PCR-Southern雜交陽性率為1 00﹪.說明外源基因已穩(wěn)定整合到小黑楊花粉基因組中.轉(zhuǎn)基因小黑楊的蟲飼試驗(yàn)表明,接舞毒蛾2齡幼蟲,殺蟲率達(dá)62.5﹪~92.5﹪,陰性對(duì)照植株蟲飼死亡率5﹪~13.3﹪,陽性植株飼喂舞毒蛾死亡率高于陰性對(duì)照植株飼喂舞毒蛾死亡率,而且集中在飼蟲初期,說明基因表達(dá)產(chǎn)物水平較高.咬食轉(zhuǎn)基因植株的尚存活舞毒蛾平均蟲

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