雙價(jià)抗蟲基因楊的獲得、抗蟲鑒定及安全性評(píng)價(jià).pdf

1、楊樹屬楊柳科(Salicacea)楊屬(Populus)，是世界上分布最廣、適應(yīng)性最強(qiáng)的樹種，對(duì)保持生態(tài)平衡起著重要的作用，它不僅是世界上最重要的紙漿原料，還是優(yōu)良的再生能源的原料。但楊樹蟲害發(fā)生嚴(yán)重，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)損失。利用基因工程培育抗蟲品種是提高楊樹抗蟲性的有效途徑。我國(guó)是世界上第一個(gè)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲楊的國(guó)家，所采用的基因?yàn)樘K云金芽孢桿菌內(nèi)毒素基因（Bt基因），但單一基因易引起害蟲抗性的產(chǎn)生，同時(shí)轉(zhuǎn)入兩個(gè)或兩個(gè)以上

2、抗蟲基因能有效延緩害蟲抗性的產(chǎn)生，同時(shí)提高轉(zhuǎn)基因品種的抗蟲性，擴(kuò)大其擴(kuò)蟲譜。本研究發(fā)明了不需通過植物組織培養(yǎng)的“原位葉芽基因轉(zhuǎn)化法”，并采用該方法將源于東亞鉗蝎的昆蟲特異性毒素(BmkIT)基因與源于煙草天蛾的幾丁質(zhì)酶(chitinase)基因構(gòu)建的雙價(jià)基因?qū)霔顦?，并分析了該雙價(jià)基因的抗蟲效果，探討了其抗蟲楓理，進(jìn)而以食草動(dòng)物兔子為動(dòng)物材料，研究了轉(zhuǎn)chitinase-BmkIT楊樹葉作為青飼料的安全性問題。獲得的主要結(jié)果如下:

3、>　　一、原位葉芽轉(zhuǎn)化雙價(jià)基因
　　以青楊(Populus cathayana Rehd)品種中林美荷為供試植物材料，連續(xù)三年采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的原位葉芽轉(zhuǎn)化法對(duì)雙價(jià)基因chitinase-BmkIT進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，該方法能夠?qū)⑼庠椿蜣D(zhuǎn)入楊樹中，頂芽的轉(zhuǎn)化率高于側(cè)芽。雖然該方法會(huì)產(chǎn)生嵌合體，通過連續(xù)兩年用標(biāo)記抗生素卡那霉素篩選及PCR擴(kuò)增檢測(cè)，淘汰了嵌合體，分別得到1％(2006年)和2.24％(2007年)的轉(zhuǎn)化率，South

4、ern雜交表明，雙價(jià)基因確已整合到楊樹基因組中，整合方式既有單拷貝也有多拷貝。將轉(zhuǎn)化枝扦插繁殖后，分子檢測(cè)證明外源基因可以通過無性繁殖方式遺傳。
　　二、轉(zhuǎn)雙價(jià)基因楊的抗蟲性鑒定
　　分別以蛀桿害蟲光肩星天牛幼蟲和食葉害蟲美國(guó)白蛾幼蟲為供試蟲源，進(jìn)行了抗蟲研究。通過對(duì)一齡光肩星天牛取食轉(zhuǎn)基因楊樹莖干30天后與對(duì)照比較，表明轉(zhuǎn)chitinase-BmkIT基因楊對(duì)天牛生長(zhǎng)基本無抑制作用，表現(xiàn)在取食轉(zhuǎn)基因楊莖桿的天牛與取食非轉(zhuǎn)化

5、對(duì)照的天牛體重和體長(zhǎng)均無顯著差異(p＞0.05)，且觀察表明，兩組天牛所蛀隧洞大小也無明顯差異。
　　轉(zhuǎn)chitinase-BmkIT基因楊對(duì)美國(guó)白蛾有一定的抑制作用，表現(xiàn)在取食轉(zhuǎn)基因葉片不僅對(duì)美國(guó)白蛾當(dāng)代的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了抑制和致死作用，且對(duì)其后代的繁衍造成了抑制。研究結(jié)果表明，取食轉(zhuǎn)基因株系楊樹葉片使美國(guó)白蛾的死亡率顯著提高，且對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲身長(zhǎng)和體重的抑制顯著高于取食非轉(zhuǎn)化株系(p＜0.05)，而且，取食轉(zhuǎn)基因葉片使部分美國(guó)白

6、蛾幼蟲不能化蛹，即使化蛹，卻不能羽化或羽化不正常，未能交配即死亡，因而可以有效降低美國(guó)白蛾的危害。
　　三、轉(zhuǎn)雙價(jià)基因楊的抗蟲機(jī)理探討
　　為探討雙價(jià)基因chitinase-BmkIT的抗蟲機(jī)理，以轉(zhuǎn)雙價(jià)基因(chitinase-BmkIT)楊樹葉片飼喂美國(guó)白蛾幼蟲，采用石蠟切片法，對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲中腸結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，并對(duì)其頭部乙酰膽堿酯酶活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明:取食轉(zhuǎn)基因楊樹葉片的美國(guó)白蛾幼蟲中腸結(jié)構(gòu)不完整，中腸細(xì)胞出現(xiàn)排列不

7、整齊、脫落等現(xiàn)象。本試驗(yàn)中，取食未轉(zhuǎn)化葉片的美國(guó)白蛾幼蟲頭部乙酰膽堿酯酶活性顯著高于對(duì)照處理，極有可能是BmkIT基因表達(dá)的結(jié)果。興奮型昆蟲特異性神經(jīng)毒素BmkIT可能會(huì)通過抑制乙酰膽堿酯酶活性，造成昆蟲過度興奮而死亡或生長(zhǎng)受抑。幾丁質(zhì)酶通過水解幾丁質(zhì)發(fā)揮作用，中腸切片表明，取食轉(zhuǎn)化葉片的幼蟲中腸結(jié)構(gòu)不完整，有細(xì)胞脫落、斷裂現(xiàn)象，表明外源幾丁質(zhì)酶在昆蟲體內(nèi)仍有活性，并通過對(duì)圍食膜的破壞造成昆蟲易感病、拒食、身體潰爛等現(xiàn)象。切片觀察與乙酰

8、膽堿酯酶活性測(cè)定為證實(shí)此雙價(jià)基因的抗蟲效應(yīng)和闡明此雙價(jià)基因的抗蟲機(jī)理提供了證據(jù)。
　　四、轉(zhuǎn)雙價(jià)基因楊對(duì)兔子的安全評(píng)價(jià)
　　為明確轉(zhuǎn)雙價(jià)抗蟲基因（chitinase-BmkIT）楊作為飼料的安全性，本研究以食草動(dòng)物兔子為材料，通過連續(xù)70天飼喂一定量的轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諚顦湫迈r葉片，比較了飼喂前后血常規(guī)及血生化部分指標(biāo);記錄了取食轉(zhuǎn)基因葉片及非轉(zhuǎn)化葉對(duì)兔子生長(zhǎng)的影響;對(duì)處理組和對(duì)照組兔子解剖后觀察并稱重，分析了兩組的臟器比

9、;石蠟切片比較了處理組和對(duì)照組兔子的組織形態(tài)結(jié)構(gòu);檢測(cè)了外源基因在兔子組織中的整合情況。結(jié)果表明:取食轉(zhuǎn)基因楊樹葉與非轉(zhuǎn)化葉兔子的生長(zhǎng)無顯著差異;處理組兔的肝臟重于對(duì)照組，但兩組兔子的肝組織形態(tài)均正常，且無差異，其它臟器如腎、脾、胃、小腸、心臟、肺均無病理變化;試驗(yàn)結(jié)束后，兩組兔子的生化及血常規(guī)指標(biāo)均無顯著差異;源于轉(zhuǎn)基因楊樹葉的chitinase，BmkIT, kanamycin均未在兔子的小腸、血液及肌肉中檢出。以上結(jié)果初步說明，轉(zhuǎn)