主要糧食作物深加工制品轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、隨著各國(guó)有關(guān)GMO標(biāo)簽法的建立和不斷完善，對(duì)食品中的GMO含量的下限已有所規(guī)定且不斷下降。但目前為止，國(guó)際上尚未建立對(duì)糧食作物深加工制品轉(zhuǎn)基因成分準(zhǔn)確的定性和定量檢測(cè)技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)主要糧食作物深加工制品的轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了深入研究，旨在于建立一套深加工轉(zhuǎn)基因制品的DNA提取、定性和定量檢測(cè)技術(shù)體系，為最終建立快速、高效和準(zhǔn)確的GMO標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法提供依據(jù)。 ⑴在DNA提取方法研究的方面，篩選了多種DNA提取技術(shù)和方法，結(jié)果

2、將Wizard()試劑盒確定為深加工制品的最佳提取方法。與其它DNA提取方法相比較，該試劑盒提簡(jiǎn)單、快速，DNA富集效果最佳，所提取的DNA作為模板進(jìn)行隨后的定性和定量檢測(cè)，得到最佳結(jié)果。 ⑵在定性檢測(cè)技術(shù)方面，建立了多重巢式PCR轉(zhuǎn)基因檢測(cè)體系。針對(duì)已商品化的大豆、玉米和水稻主要含有CrylA(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因、PAT基因及共同的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因RBCL基因的特點(diǎn)設(shè)計(jì)了10對(duì)引物，其中包括5對(duì)外引物和5對(duì)

3、內(nèi)引物，對(duì)大豆、玉米和水稻經(jīng)深加工的11個(gè)未知樣品進(jìn)行了多重巢式PCR定性檢測(cè)。結(jié)果顯示，在l1份未知樣品中，卵磷脂、大豆蛋白質(zhì)粉、巧克力飲品、嬰兒米粉含有轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因成分；玉米淀粉和玉米泥含有轉(zhuǎn)CrylA(B)基因和PAT基因成分；玉米蛋白粉含有轉(zhuǎn)CrylA(B)基因和BAR基因成分；營(yíng)養(yǎng)麥片含有轉(zhuǎn)CrylA(B)基因成分：大豆精煉油、大豆色拉油和玉米油在定性檢測(cè)中未檢測(cè)出任何條帶，結(jié)果與巢式PCR結(jié)果一致。多重巢式PCR

4、適用于轉(zhuǎn)基因深加工制品的定性檢測(cè)，靈敏度達(dá)到0.005％，優(yōu)于已有的PCR檢測(cè)方法，該定性檢測(cè)方法具有特異、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可以篩選多種轉(zhuǎn)基因成分的特點(diǎn)，為國(guó)際上轉(zhuǎn)CrylA(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因、PAT基因深加工制品轉(zhuǎn)基因檢測(cè)提供了有效的檢測(cè)技術(shù)。 ⑶建立了基于熔解曲線的多重RealtimePCR轉(zhuǎn)基因定性檢測(cè)體系。針對(duì)CrylA(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因、PAT基因設(shè)計(jì)特異性強(qiáng)且每個(gè)基

5、因擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度各不相同的引物，進(jìn)行多重RealtimePCR反應(yīng)。最終建立了對(duì)于CrylA(B)基因、CP4基因與PAT基因、BAR基因的兩個(gè)雙重PCR反應(yīng)體系，檢測(cè)靈敏度都可達(dá)0.1％：對(duì)于CP4基因、PAT基因和BAR基因的的三重PCR反應(yīng)，檢測(cè)靈敏度為0.5％：對(duì)于CrylA(B)基因、CP4基因、PAT基因和BAR基因的的四重PCR反應(yīng)，檢測(cè)靈敏度為1％，以上多重RealtimePCR轉(zhuǎn)基因檢測(cè)體系的檢測(cè)限度都低于已建立的

6、GMO規(guī)范閾值。因此，這些最新建立的基于熔解曲線的Real-timePCR體系足以滿足常規(guī)GMO定性檢測(cè)。 ⑷在定量檢測(cè)技術(shù)方面，建立了TaqMan和SYBRGreenI兩種方法的轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)體系，并比較二者檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)證明，TaqMan探針和SYBRGreenI染料法在標(biāo)準(zhǔn)品定量分析試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)差均小于0.2，靈敏度均達(dá)到0.01％，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有差異。同時(shí)SYBRGreenI定量檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)便快速、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、成本

7、低、結(jié)果可信的特點(diǎn)，完全適用于深加工制品的轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)。 ⑸建立了基于多重PCR反應(yīng)的基因芯片轉(zhuǎn)基因檢測(cè)體系，檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.25％。構(gòu)建了可以檢測(cè)轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因、CrylA(B)基因、BAR基因和PAT基因的定性標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)粒。以解決實(shí)驗(yàn)室普遍缺乏陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的問(wèn)題。 ⑹建立了一整套簡(jiǎn)便、精確、快捷、成熟、可信度高的轉(zhuǎn)基因糧食作物深加工制品檢測(cè)技術(shù)體系，將為我國(guó)糧食作物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定性、定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化提供