主要糧食作物深加工制品轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)研究.pdf

1、隨著各國有關(guān)GMO標簽法的建立和不斷完善，對食品中的GMO含量的下限已有所規(guī)定且不斷下降。但目前為止，國際上尚未建立對糧食作物深加工制品轉(zhuǎn)基因成分準確的定性和定量檢測技術(shù)。本實驗對主要糧食作物深加工制品的轉(zhuǎn)基因成分的檢測技術(shù)進行了深入研究，旨在于建立一套深加工轉(zhuǎn)基因制品的DNA提取、定性和定量檢測技術(shù)體系，為最終建立快速、高效和準確的GMO標準檢測方法提供依據(jù)。 ⑴在DNA提取方法研究的方面，篩選了多種DNA提取技術(shù)和方法，結(jié)果

2、將Wizard()試劑盒確定為深加工制品的最佳提取方法。與其它DNA提取方法相比較，該試劑盒提簡單、快速，DNA富集效果最佳，所提取的DNA作為模板進行隨后的定性和定量檢測，得到最佳結(jié)果。 ⑵在定性檢測技術(shù)方面，建立了多重巢式PCR轉(zhuǎn)基因檢測體系。針對已商品化的大豆、玉米和水稻主要含有CrylA(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因、PAT基因及共同的內(nèi)標準基因RBCL基因的特點設(shè)計了10對引物，其中包括5對外引物和5對

3、內(nèi)引物，對大豆、玉米和水稻經(jīng)深加工的11個未知樣品進行了多重巢式PCR定性檢測。結(jié)果顯示，在l1份未知樣品中，卵磷脂、大豆蛋白質(zhì)粉、巧克力飲品、嬰兒米粉含有轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因成分；玉米淀粉和玉米泥含有轉(zhuǎn)CrylA(B)基因和PAT基因成分；玉米蛋白粉含有轉(zhuǎn)CrylA(B)基因和BAR基因成分；營養(yǎng)麥片含有轉(zhuǎn)CrylA(B)基因成分：大豆精煉油、大豆色拉油和玉米油在定性檢測中未檢測出任何條帶，結(jié)果與巢式PCR結(jié)果一致。多重巢式PCR

4、適用于轉(zhuǎn)基因深加工制品的定性檢測，靈敏度達到0.005％，優(yōu)于已有的PCR檢測方法，該定性檢測方法具有特異、穩(wěn)定、準確、可以篩選多種轉(zhuǎn)基因成分的特點，為國際上轉(zhuǎn)CrylA(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因、PAT基因深加工制品轉(zhuǎn)基因檢測提供了有效的檢測技術(shù)。 ⑶建立了基于熔解曲線的多重RealtimePCR轉(zhuǎn)基因定性檢測體系。針對CrylA(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因、PAT基因設(shè)計特異性強且每個基

5、因擴增產(chǎn)物的解鏈溫度各不相同的引物，進行多重RealtimePCR反應(yīng)。最終建立了對于CrylA(B)基因、CP4基因與PAT基因、BAR基因的兩個雙重PCR反應(yīng)體系，檢測靈敏度都可達0.1％：對于CP4基因、PAT基因和BAR基因的的三重PCR反應(yīng)，檢測靈敏度為0.5％：對于CrylA(B)基因、CP4基因、PAT基因和BAR基因的的四重PCR反應(yīng)，檢測靈敏度為1％，以上多重RealtimePCR轉(zhuǎn)基因檢測體系的檢測限度都低于已建立的

6、GMO規(guī)范閾值。因此，這些最新建立的基于熔解曲線的Real-timePCR體系足以滿足常規(guī)GMO定性檢測。 ⑷在定量檢測技術(shù)方面，建立了TaqMan和SYBRGreenI兩種方法的轉(zhuǎn)基因定量檢測體系，并比較二者檢測結(jié)果。實驗證明，TaqMan探針和SYBRGreenI染料法在標準品定量分析試驗中標準差均小于0.2，靈敏度均達到0.01％，兩種方法的檢測結(jié)果沒有差異。同時SYBRGreenI定量檢測方法具有簡便快速、經(jīng)濟實用、成本

7、低、結(jié)果可信的特點，完全適用于深加工制品的轉(zhuǎn)基因成分定量檢測。 ⑸建立了基于多重PCR反應(yīng)的基因芯片轉(zhuǎn)基因檢測體系，檢測靈敏度可達0.25％。構(gòu)建了可以檢測轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因、CrylA(B)基因、BAR基因和PAT基因的定性標準分子質(zhì)粒。以解決實驗室普遍缺乏陽性標準物質(zhì)的問題。 ⑹建立了一整套簡便、精確、快捷、成熟、可信度高的轉(zhuǎn)基因糧食作物深加工制品檢測技術(shù)體系，將為我國糧食作物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定性、定量檢測標準化提供