轉(zhuǎn)基因番木瓜和番茄分子檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、自1983年世界首例轉(zhuǎn)基因煙草作物問世以來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在世界范圍內(nèi)對(duì)農(nóng)作物的生產(chǎn)和遺傳改良產(chǎn)生深刻的影響，但基因工程可能導(dǎo)致我們無法預(yù)測(cè)的植物性狀改變，有時(shí)這種改變?cè)诙虝r(shí)期內(nèi)甚至難以覺察，但卻可能給環(huán)境、生態(tài)系統(tǒng)、人身健康帶來巨大的風(fēng)險(xiǎn)。為了加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品的管理，各國都出臺(tái)了各種管理辦法和政策。因此，開展轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法研究具有重大的社會(huì)意義和實(shí)際意義。本研究針對(duì)轉(zhuǎn)基因番木瓜和番茄，分別建立了常規(guī)定性PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)

2、。主要研究內(nèi)容如下： 轉(zhuǎn)基因番木瓜和番茄常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù) 1.選用核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基基因(ribulosebisphosphatecarboxylase/oxygenaselargesubunit)作為植物通用的內(nèi)源對(duì)照基因，設(shè)計(jì)通用引物，采用番木瓜，番茄，草莓進(jìn)行試驗(yàn)研究。結(jié)果表明，RBCL基因可以作為轉(zhuǎn)基因番木瓜和番茄的內(nèi)源基因。 2.針對(duì)轉(zhuǎn)基因番木瓜和番茄中常見的外源基因序列CaMV

3、35S啟動(dòng)子序列，NOS終止子序列，NPTII基因，GUS基因，CH5B基因，OSMOTIN基因，PRSV-CP基因，PRSV-RP基因分別設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行了普通定性PCR檢測(cè)研究。并優(yōu)化了PCR反應(yīng)體系。 3.設(shè)計(jì)了35S/NOS引物，35S/CP引物，實(shí)現(xiàn)了一對(duì)引物定性PCR可以檢測(cè)到2個(gè)或以上外源基因片斷。 4.建立了雙重和三重定性PCR的檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了“一管多檢”。并優(yōu)化了PCR反應(yīng)體系。 5.同時(shí)對(duì)

4、PRSV-CP基因，PRSV-RP基因，CH5B基因，OSMOTIN基因，GUS基因的全序列進(jìn)行克隆測(cè)序，提取其陽性質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)過程中的陽性對(duì)照物質(zhì)；測(cè)定出不同轉(zhuǎn)PRSV-CP基因番木瓜品系中35S和CP基因之間的不同邊界連接序列。 轉(zhuǎn)基因番木瓜和番茄實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù) 6.首次利用SYBRGreen實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，并建立了SYBRGreen實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因水果通用內(nèi)源基因RBCL基因，外源

5、CaMV35S基因，NOS基因，NPTII基因，PRSV-CP基因，PRSV-RP基因，CH5B基因，OSMOTIN基因，GUS基因的檢測(cè)。 7.建立Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因水果通用內(nèi)源基因RBCL基因，外源CaMV35S基因，NOS基因，NPTII基因，PRSV-CP基因，PRSV-RP基因，CH5B基因，OSMOTIN基因，GUS基因的檢測(cè)；同時(shí)也建立了雙重Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因番木瓜Rain