雙重PCR和競(jìng)爭(zhēng)性PCR檢測(cè)馬鈴薯環(huán)腐病菌和黑脛病菌技術(shù)體系建立.pdf

1、馬鈴薯是世界上僅次于水稻、小麥和玉米的第四大糧食作物,我國為世界第一大馬鈴薯生產(chǎn)國。馬鈴薯環(huán)腐病(Clavibacter michiganensis subsp.Sepedonicus,Cms)和黑脛病(Pectobacterium atroseptica,Eca)是影響馬鈴薯生產(chǎn)的兩個(gè)重要的種薯傳播細(xì)菌性病害,能夠快速、準(zhǔn)確、靈敏、可靠地檢測(cè)這兩種病害對(duì)降低種薯帶菌減輕病害發(fā)生具有重要意義。本研究建立了雙重PCR檢測(cè)黑脛病菌和環(huán)腐病菌

2、技術(shù)和競(jìng)爭(zhēng)性PCR定量檢測(cè)黑脛病菌技術(shù)。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1.根據(jù)GenBank上發(fā)表的馬鈴薯環(huán)腐病菌pCS1質(zhì)粒上纖維素酶A基因序列,對(duì)比近緣種及馬鈴薯上幾種重要病原細(xì)菌的核苷酸序列,設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)特異性引物CMS1／CMS2,利用引物CMS1／CMS2擴(kuò)增出了一條913bp的馬鈴薯環(huán)腐病菌特異性條帶,而馬鈴薯環(huán)腐病菌近緣種和馬鈴薯上的重要病原菌均未擴(kuò)增出任何條帶,特異性很高。檢測(cè)靈敏度在DNA水平

3、上達(dá)100fg／μL,在細(xì)菌數(shù)量上達(dá)105CFU／mL。
　　 2.將設(shè)計(jì)的引物CMS1／CMS2與已發(fā)表的PCR檢測(cè)馬鈴薯黑脛病菌特異性引物ECA1f／ECA2r結(jié)合,經(jīng)過條件優(yōu)化后,成功建立了雙重PCR技術(shù)體系。利用該雙重PCR體系對(duì)馬鈴薯環(huán)腐病菌和黑脛病菌進(jìn)行擴(kuò)增,可獲得913bp和690bp的2條特異性條帶,而15種對(duì)照菌株均未擴(kuò)增出任何條帶,檢測(cè)靈敏度在DNA水平上達(dá)600fg／μL,在細(xì)菌數(shù)量上達(dá)5×105CFU／m

4、L。應(yīng)用該體系對(duì)患環(huán)腐病和(或)黑脛病的薯塊進(jìn)行了檢測(cè),能夠檢測(cè)到環(huán)腐病菌和(或)黑脛病菌的存在。實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)馬鈴薯環(huán)腐病菌和黑脛病菌的快速可靠檢測(cè)。
　　 3.應(yīng)用黑脛病菌特異性引物ECA1f／ECA2r擴(kuò)增黑脛病菌DNA,將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物序列和引物ECA1f／ECA2r序列,設(shè)計(jì)了新引物ECA3f,與ECA2r組合擴(kuò)增黑脛病菌DNA,制備競(jìng)爭(zhēng)性模板。將競(jìng)爭(zhēng)性模板插入。pEASY-T1克隆載體,導(dǎo)入Trans1