膠體金速測卡研制及柑橘潰瘍病菌快速診斷.pdf

1、柑橘潰瘍病(Citrus bacterial canker disease，CBCD)是一種由柑橘黃單胞菌(Xanthomonas citri pv.citri,Xcc)所引起的，危害全世界柑橘種植業(yè)最嚴(yán)重的檢疫性細(xì)菌病害。該病能侵染絕大多數(shù)多種蕓香科植物，包括柑橘屬的絕大多數(shù)商品化栽培品種。該病主要隨帶病種苗等繁殖材料遠(yuǎn)距離傳播，發(fā)病嚴(yán)重時往往導(dǎo)致樹勢衰退，枯枝落葉、布滿病斑、果實(shí)品質(zhì)惡劣甚至未熟先落，嚴(yán)重影響柑橘的產(chǎn)量和質(zhì)量。由于抗

2、病品種和特效藥劑的匱乏，針對發(fā)病植株仍采用挖除病樹集中燒毀的鏟除方式。目前對該病的防控措施主要依靠加強(qiáng)植物檢疫檢測，早期診斷病害，切斷傳播源頭。隨著我國經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，柑橘產(chǎn)品的調(diào)運(yùn)和交易更加頻繁，人為傳播的危險性急劇加大，在這樣的形勢下迫切需要更多更好的檢測技術(shù)手段，特別是快速簡便、可用于現(xiàn)場診斷的方法。
　　膠體金溶液分散相中的金原子直徑在l~150nm之間，隨著顆粒大小的不同溶膠顏色呈現(xiàn)由紅到紫的變化。膠體金免疫技術(shù)(ICG)

3、是以膠體金顆粒作為顯色物質(zhì)或示蹤標(biāo)記物，標(biāo)記于抗原或抗體上，直觀反映抗原抗體之間相互作用的新型免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金顆粒本身無毒，能夠迅速而穩(wěn)定地吸附于所有生物大分子上，但不改變大分子的生物活性，因此作為一種安全的探針?biāo)梢赃M(jìn)行切片定位及日常診斷技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)是快速、靈敏、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，且操作簡便、無需任何儀器設(shè)備，結(jié)果判斷直觀可靠、易被基層人員掌握。因而在電鏡、免疫印跡、體外診斷試劑盒的制造、藥物殘留測試、臨床疾病診斷等等領(lǐng)域都得到

4、了廣泛的應(yīng)用。
　　本研究針對柑橘潰瘍病菌現(xiàn)有檢測技術(shù)在基層田間難于進(jìn)行現(xiàn)場快速診斷的缺陷，利用重慶大學(xué)基因工程研究中心前期篩選的重組抗體，制備并比較單克隆抗體、多克隆抗體與重組抗體的實(shí)際應(yīng)用性能，研發(fā)柑橘潰瘍病菌快速診斷膠體金速測卡，可望為柑橘潰瘍病菌的診斷提供一種簡便、快速、便于基層使用的檢測手段。主要研究結(jié)果如下：
　?、賹⒅苽洳⑻峒兊目筙cc單克隆抗體、多克隆抗體及重組抗體，采用間接ELISA方法對比，篩選出兩株特異

5、性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的抗體(Xcc-2D8和Xcc-2D6效價均為1:128,000以上)，應(yīng)用于膠體金速測卡的研發(fā)。
　?、诓捎脵幟仕崛c還原法制備膠體金顆粒，所制金溶膠狀態(tài)為鮮紅透亮，離心無掛壁無黑色顆粒沉淀。通過紫外400~600nm掃描，吸收峰寬小，粒子分布均勻，最大吸收峰波長在520nm左右，為標(biāo)記所需顆粒大小。
　?、弁ㄟ^pH梯度測定金標(biāo)抗體最適pH標(biāo)記范圍在9.0~9.5左右。通過抗體濃度梯度測定金顆粒最適添加抗體量

6、在20mg/mL以上。
　?、艽_定各類層析材料以及各層析材料的預(yù)處理方式。金標(biāo)抗體固定于金標(biāo)墊上；利用雙抗夾心原理，將檢測抗體(Xcc-2D6)和二抗抗體(山羊抗小鼠IgG)分別固定于硝酸纖維素膜上，作為檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，組裝膠體金速測卡密封干燥保存。
　　⑤用Xcc菌懸液及柑橘樣本浸后液對所制膠體金速測卡進(jìn)行檢測評價。速測卡對Xcc菌懸液的檢測下限為1×103~4cfu/mL，對多個地區(qū)的20