四種常見食物中毒致病菌膠體金免疫滲濾法快速診斷的初步研究.pdf

1、細菌性食物中毒無論在發(fā)達國家還是在發(fā)展中國家都是一項重要的公共衛(wèi)生問題。根據(jù)國內(nèi)外的統(tǒng)計，在發(fā)生的各種類型食物中毒中，均以細菌性食物中毒最為多見。沙門氏菌、副溶血性弧菌、致病性大腸埃希菌、產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌等腸道致病菌是引起食物中毒及疾病散發(fā)的主要病原菌，特別是近年來出現(xiàn)了大腸桿菌“O157”和霍亂弧菌“O139”引起的食物中毒。食源性疾病嚴重威脅著人們的健康，應(yīng)當(dāng)引起全社會的廣泛重視。 細菌性食物中毒起病急，患者集中，因而

2、快速準確的診斷對疫情的控制尤為重要。細菌性食物中毒常用的診斷方法有病原學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)法結(jié)果可靠，但費時費力；酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)等，雖能縮短檢測時間，但需要一定的實驗條件；PCR技術(shù)靈敏性及特異性較高，但成本也高，且容易出現(xiàn)假陽性；免疫膠體金技術(shù)，以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，其檢測靈敏性和特異性與ELISA相當(dāng)，但是更簡單，方便，快速。膠體金與抗體結(jié)合，不影響抗體活性，標(biāo)記效率高，反應(yīng)快速，結(jié)果肉眼

3、即可讀取。本研究即利用自制的抗副溶血弧菌、抗金黃色葡萄球菌及抗鼠傷寒沙門氏菌多克隆抗體和抗霍亂弧菌單克隆抗體初步建立免疫膠體金滲濾法(Dot-immunogoldfiltrationassay，DIGFA)，用于副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌及霍亂弧菌引起的食物中毒的初篩。 目的： 1.初步建立檢測副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌及霍亂弧菌的免疫膠體金滲濾法，用于上述病原菌所致食物中毒的初篩。

4、 2.初步評價所建立免疫膠體金滲濾法的應(yīng)用價值。 方法： 1.細菌菌體抗原制備：參照文獻報道，采用煮沸法滅活，制備副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌菌體抗原。 2.抗血清制備：分別以副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌及鼠傷寒沙門氏菌菌體抗原，耳緣靜脈注射免疫家兔，制備多克隆抗血清?？够魜y弧菌單克隆抗體3A6、1F5已由本室制得并保存。 3.抗血清純化：采用抗原吸收法及飽和硫酸銨分級沉淀法純化多克隆抗體。

5、 4.多克隆抗體的檢測：間接ELISA法檢測抗體效價；用核酸蛋白分析儀測定蛋白含量；采用SDS-PAGE電泳鑒定抗體純度。 5.膠體金免疫滲濾法的建立：利用已獲得的多克隆抗體及單克隆抗體，結(jié)合膠體金標(biāo)記技術(shù)初步建立了檢測副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌及霍亂弧菌的免疫膠體金滲濾法，并優(yōu)化檢測條件。 6.膠體金免疫滲濾法的分析：應(yīng)用建立的方法分別檢測副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌及霍亂弧菌，并

6、分析其檢測靈敏性、特異性、重復(fù)性及試劑穩(wěn)定性。 7.膠體金免疫滲濾法實用價值評價：用建立的免疫膠體金滲濾法檢測人工制備的食物中毒模擬標(biāo)本，并與雙抗體夾心ELISA法比較，評價該方法實用價值。 結(jié)果： 1.成功制備了抗副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌及鼠傷寒沙門氏菌菌體抗原的多克隆抗體。 2.抗副溶血弧菌多克隆抗體、抗金黃色葡萄球菌多克隆抗體及抗鼠傷寒沙門氏菌多克隆抗體經(jīng)純化后，效價均可達到1∶80,000左右；

7、其蛋白濃度依次為4.812mg/ml、3.678mg/ml及5.854mg/ml；SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，純度較好，條帶主要集中于50KD左右。 3.初步建立了檢測副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌及霍亂弧菌的免疫膠體金滲濾法。優(yōu)化后檢測條件為：(1)以0.45μm的微孔濾膜作為反應(yīng)支持物；(2)三種多克隆抗體均以原濃度包被微孔濾膜，每檢測點包被2μll抗體，抗霍亂弧菌單抗以1mg/ml的3A62μl包被，此外，多

8、克隆抗體以1mg/ml的羊抗兔IgG2μl包被，作為質(zhì)控點，單克隆抗體以1mg/ml的羊抗鼠IgG2μl作為質(zhì)控點；(3)以1％BSA室溫，3h封閉微孔濾膜；(4)金標(biāo)抗副溶血弧菌多抗、金標(biāo)抗鼠傷寒沙門氏菌多抗均以1∶2稀釋倍數(shù)為最適檢測濃度，金標(biāo)抗金黃色葡萄球菌多抗以1∶6倍稀釋，金標(biāo)抗霍亂弧菌單抗1F5以1∶10倍稀釋作為工作濃度；(5)10-15min可觀察檢測結(jié)果。 4.建立的膠體金免疫滲濾法，檢測靈敏性達到1×108c

9、fu/ml-3×106cfu/ml，換算為檢測體系中的菌量，則副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌和霍亂弧菌的檢測體系靈敏性依次為2×105cfu、2×105cfu、2×104cfu、6×103cfu。 5.建立的免疫滲濾法檢測體系中，金標(biāo)霍亂弧菌單抗體系及金標(biāo)抗金黃色葡萄球菌多抗體系特異性好。另兩種檢測體系均與金黃色葡萄球菌有交叉反應(yīng)。 6.膠體金免疫滲濾法重復(fù)性好；預(yù)包被濾膜置室溫7天和4℃密封干燥保存，檢測結(jié)

10、果無顯著差別，試劑穩(wěn)定性好。 7.用建立的膠體金免疫滲濾法檢測模擬食物中毒樣本，檢測靈敏性與雙抗體夾心ELISA相當(dāng)或略低。 結(jié)論： 1.成功制備了抗副溶血弧菌、抗金黃色葡萄球菌及抗鼠傷寒沙門氏菌的多克隆抗體。 2.初步建立了檢測副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌及霍亂弧菌的膠體金免疫滲濾法，并優(yōu)化了反應(yīng)條件。 3.建立的膠體金免疫滲濾法用于檢測副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌及