感病基因CsLOB1在柑橘潰瘍病抗性中的功能研究.pdf

1、柑橘潰瘍病是由黃單胞桿菌柑橘致病變種（Xanthomonas axonopodis pv.citri）引起的一種細(xì)菌性病害，它往往給柑橘產(chǎn)業(yè)造成非常嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。柑橘產(chǎn)業(yè)中大部分栽培品種屬于潰瘍病易感品種。因此，大力開展柑橘潰瘍病抗、感機(jī)理和重要基因資源挖掘的研究，對柑橘優(yōu)良抗性新品種的選育和柑橘產(chǎn)業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展具有重要意義，也將進(jìn)一步深化我們對病原菌致病機(jī)理、植物與病原互作機(jī)制的理解。研究表明，在潰瘍病病原菌侵染柑橘時，可誘導(dǎo)柑橘

2、感病基因表達(dá)，致使柑橘發(fā)病，感病基因在整個過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。通過突變或沉默感病基因，柑橘可能會獲得廣譜抗病性，感病基因也可能會轉(zhuǎn)變成為廣譜抗病基因，這也為柑橘抗病育種改良提供了一個新思路。
　　CsLOB1基因?yàn)長BD轉(zhuǎn)錄因子基因家族中的一員，屬感病基因，它受潰瘍病菌誘導(dǎo)表達(dá)，但其參與柑橘寄主感病的機(jī)制尚未清楚。本實(shí)驗(yàn)前期工作構(gòu)建了CsLOB1基因的RNAi表達(dá)載體和超量表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)將其導(dǎo)入錦橙，獲得轉(zhuǎn)基因錦

3、橙。本研究主要從野生型不同抗性品種CsLOB1基因表達(dá)特征、轉(zhuǎn)基因錦橙的抗病性、CsLOB1基因的異位表達(dá)對相關(guān)基因的影響等方面初步探討CsLOB1感病基因在柑橘潰瘍病抗性中的功能。主要研究結(jié)果如下：
　　1.不同抗性品種CsLOB1基因的表達(dá)譜
　　無論錦橙還是金柑，均是剛展開幼葉中CsLOB1基因的表達(dá)水平高于嫩葉和老葉。
　　分別對野生型錦橙（易感）和野生型金柑（抗病）進(jìn)行潰瘍病離體接菌，1d、3d、5d、7d、

4、9d后進(jìn)行CsLOB1基因的實(shí)時定量PCR分析，結(jié)果顯示，隨接菌時間的延長該基因的表達(dá)水平呈上升趨勢，且各時期該基因的在錦橙中的表達(dá)水平均顯著高于金柑。顯示CsLOB1基因的表達(dá)與柑橘潰瘍病抗性緊密相關(guān)。
　　2.異位表達(dá)CsLOB1基因?qū)Ω涕贊儾】剐缘挠绊?br>　　對轉(zhuǎn)基因錦橙離體抗性評價表明，超量表達(dá)CsLOB1基因能顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的感病性，而RNAi抑制CsLOB1基因的表達(dá)能顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的抗病性。
　　

5、3.異位表達(dá)CsLOB1基因?qū)D(zhuǎn)基因植株表型的影響
　　觀察發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)CsLOB1基因的錦橙與同代野生型錦橙有明顯的表型差異，出現(xiàn)植株矮小，葉片皺褶成簇且較小，分支嚴(yán)重等情況；嫁接后代成活率很低，尤其表型特異植株后代基本均未成活。而抑制CsLOB1基因的表達(dá)對轉(zhuǎn)基因植株無明顯的表型影響。
　　4.CsLOB1基因的亞細(xì)胞定位
　　構(gòu)建融合基因表達(dá)載體PLGN-35s-CsLOB1:mGFP，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮

6、細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，CsLOB1:mGFP蛋白在細(xì)胞核優(yōu)勢富集，表明CsLOB1基因定位于細(xì)胞核。
　　5.異位表達(dá)CsLOB1基因?qū)?xì)胞壁重構(gòu)相關(guān)基因的影響
　　對轉(zhuǎn)基因錦橙中的擴(kuò)張蛋白基因、果膠裂解酶基因和酸性纖維素酶基因的表達(dá)進(jìn)行定量PCR分析，結(jié)果顯示，超量表達(dá)CsLOB1基因的轉(zhuǎn)基因錦橙中三個基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而RNAi抑制CsLOB1基因的轉(zhuǎn)基因錦橙中，三個基因的表達(dá)水平下調(diào)，但下調(diào)并不顯著。表明