改良型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)金黃色葡萄球菌的研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）廣泛分布于自然界中，因此，該菌很容易污染食品，嚴(yán)重的甚至?xí)斐墒澄镏卸?金黃色葡萄球菌也是引發(fā)臨床性疾病的主要病原微生物，當(dāng)前已有的常規(guī)檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)、需要專門的儀器設(shè)備或?qū)I(yè)人才，不利于該菌的快速檢測(cè)，因此，針對(duì)該菌建立一種快速、靈敏的檢測(cè)方法具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義，也將為解決當(dāng)今食品安全問(wèn)題提供重要的技術(shù)支持。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)能夠高效、快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)核酸，

2、但該技術(shù)在檢測(cè)過(guò)程中易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，從而限制該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。本文建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增-單分子信標(biāo)方法，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)金黃色葡萄球菌，并對(duì)該方法及其檢測(cè)特異性、靈敏度等方面進(jìn)行了研究。
　　本實(shí)驗(yàn)確定了金黃色葡萄球菌培養(yǎng)方法、作出了金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線，確定了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期，并對(duì)該菌進(jìn)行了平板計(jì)數(shù)，為后續(xù)LAMP及SMB-LAMP檢測(cè)方法的靈敏度確定提供了定量結(jié)果;通過(guò)選取不同的試驗(yàn)方法提取DNA，測(cè)定并計(jì)算出各種提取方法所

3、得DNA的OD260/OD280，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最終確定金黃色葡萄球菌基因組DNA的最優(yōu)提取方法為改良型SDS法;選取金黃色葡萄球菌特異性基因—耐熱核酸酶基因nuc作為本實(shí)驗(yàn)中LAMP擴(kuò)增的靶序列，并根據(jù)該基因的保守序列在線設(shè)計(jì)了一套LAMP擴(kuò)增引物;對(duì)該引物的LAMP反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果得出:LAMP反應(yīng)最適溫度為60℃，最佳反應(yīng)時(shí)間為45min，dNTPs最佳反應(yīng)濃度為1.4mmol/L，加入環(huán)引物比未加環(huán)引物

4、的體系反應(yīng)快15min;針對(duì)所設(shè)計(jì)的LAMP引物，選取金黃色葡萄球菌2株、大腸桿菌3株、釀膿鏈球菌1株、沙門氏菌1株進(jìn)行同步檢測(cè)，結(jié)果只有金黃色葡萄球菌顯示陽(yáng)性，證明了該引物具有良好的特異性;針對(duì)提取的DNA模板進(jìn)行濃度梯度稀釋，分別標(biāo)記:100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，同時(shí)，針對(duì)隔夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌液逐漸進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋，然后應(yīng)用改良型SDS法對(duì)稀釋液分別進(jìn)行DNA提取，最后對(duì)上述兩種方法

5、獲得的DNA分別進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，結(jié)果證明，LAMP檢測(cè)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)限為100fgDNA或者100CFU/tube，其靈敏度要比PCR檢測(cè)該菌的靈敏度高出100倍。
　　在建立的最佳LAMP反應(yīng)條件基礎(chǔ)上，結(jié)合單分子信標(biāo)(SMB)，對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行了快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，選定SMB-LAMP的反應(yīng)條件為上述LAMP優(yōu)化后的最終結(jié)果，并且選定分子信標(biāo)beacon為0.8μM。為了驗(yàn)證該反應(yīng)(SMB-LAMP)的特異性，利用金

6、黃色葡萄球菌2株、大腸桿菌1株以及沙門氏菌1株，對(duì)所設(shè)計(jì)的單分子信標(biāo)進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最后確定根據(jù)金黃色葡萄球菌nuc基因所設(shè)計(jì)的單分子信標(biāo)具有較高的特異性;同時(shí)，對(duì)所建立的SMB-LAMP法檢測(cè)金黃色葡萄球菌的靈敏度進(jìn)行了確定，最終顯示，以金黃色葡萄球菌DNA濃度梯度為SMB-LAMP反應(yīng)模板時(shí)最低檢測(cè)限為50fg，而以金黃色葡萄球菌液濃度梯度稀釋液提取DNA為模板時(shí)，最低檢測(cè)限為6CFU/tube，說(shuō)明SMB-LAMP較單純的LAMP