實(shí)時熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測牛乳中的金黃色葡萄球菌的研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），它是一種革蘭氏染色陽性菌。廣泛的存在于自然界中，可以引發(fā)人和動物的感染疾病。比如說局部化膿性炎癥和全身感染，同時也是醫(yī)院非常常見的感染病原體之一。金黃色葡萄球菌不僅能夠引起感染，而且可以產(chǎn)生腸毒素，還會引起食品污染從而導(dǎo)致食物中毒。目前發(fā)現(xiàn)，疾病的爆發(fā)與牛乳息息相關(guān)。當(dāng)前，我們用于檢測金黃色葡萄球菌的方法有:紅外分光分析技術(shù)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、PCR方法。但是這些常規(guī)

2、的檢測手段過程復(fù)雜且繁瑣，實(shí)驗(yàn)所需要的時間也比較長，同時也并沒有好的特異性以及靈敏度;免疫學(xué)方法檢測出的特異性和靈敏度相較于傳統(tǒng)常規(guī)的檢測方法有所改善但仍然達(dá)不到我們的期望值，并且相差較遠(yuǎn)。所以，建立一種高效靈敏的檢測金葡菌的方法已經(jīng)迫在眉睫。實(shí)時熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RF-SPIA)是近幾年來一種新興的核酸擴(kuò)增技術(shù)利用實(shí)時熒光檢測系統(tǒng)通過檢測熒光信號從而監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)度。反應(yīng)結(jié)束后，自動判定結(jié)果的陰性和陽性，對擴(kuò)增的結(jié)果直觀清晰的表達(dá)出

3、來。因此，這種方法可以快速檢測食源性致病菌。
　　本文利用在線軟件DNAMAN和Premier5.0對金黃色葡萄球菌(CMCC26073)的特異性基因nuc設(shè)計(jì)了一條特異性強(qiáng)的引物，對dNTPs濃度，Mg2+濃度，擴(kuò)增溫度等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系為25μL:滅菌DEPC水12μL，dNTPs0.2 mM(10 mM),2×Bca Buffer2.0μL,5×RNaseH Buffer2.0μL，單引物0.8μM,模板

4、1.5μL, Bovine Serum Albumin(BSA)0.4 mg/mL(20 mg/mL) SYBRGreenⅡ(1∶400)0.5μL Recombinant at RNase Inhibitor0.5 U/μL, Mg2+0.5 mM(25 mM), BcaDNA聚合酶0.4 U/μL（20 U/μL），核糖核酸酶RNaseH1.2 U/μL(60 U/μL)，blocker0.2 mM。反應(yīng)體系:將混合好的溶液經(jīng)95℃

5、，80 s預(yù)變性處理后降溫至60℃，迅速加入RNaseH酶和Bca DNA聚合酶，在實(shí)時熒光檢測器上60℃，反應(yīng)時間為120 min。反應(yīng)過程中通過監(jiān)測熒光信號的強(qiáng)度，來確定最合適的反應(yīng)條件，建立金黃色葡萄球菌實(shí)時熒光SPIA檢測方法。
　　本文對6株金黃色葡萄球菌和其他17株不同的致病菌進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)研究，實(shí)驗(yàn)得出6株金黃色葡萄球菌檢測結(jié)果為陽性，其他17株菌均非金黃色葡萄球菌檢測結(jié)果均為陰性。由此證明試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的引物特異性高。

6、本實(shí)驗(yàn)研究了實(shí)時熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)物的靈敏度和人工污染牛乳的檢出限。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)時熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)物的靈敏度為2.0×101 CFU/mL，金黃色葡萄球菌人工污染牛乳中的檢出限為6.0×101 CFU/mL。RF-SPIA技術(shù)比傳統(tǒng)的方法的靈敏度要高很多，不僅提高了反應(yīng)效率，還大大縮短了時間。
　　由研究結(jié)果可知，本實(shí)驗(yàn)所建立的實(shí)時熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測牛乳中的金黃色