實時熒光LAMP技術(shù)檢測牛乳中金黃色葡萄球菌的研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)是革蘭氏陽性菌的代表。一方面金黃繁殖，可產(chǎn)生腸毒素，引起食物中毒，其是人類的一種重要的食源性病原菌。許多食物，特別是肉、蛋、奶和它們制成的食品等被該菌污染的概率較大。最近幾年，越來越多的金黃色葡萄球菌食物中毒已經(jīng)成為世界性的健康問題。目前，對金黃色葡萄球菌的檢測花費時間長，不夠靈敏，并且不能對反應過程進行實時監(jiān)測，從而建立一種快速、敏感的金黃色葡萄球菌的實時檢測方法是必要的。<

2、br>　　本研究采用的實時熒光環(huán)介導等溫擴增技術(shù)是對環(huán)介導等溫擴增技術(shù)的改良;其是在LAMP體系中加入了熒光染料SYBR GreenⅠ，SYBR GreenⅠ可以結(jié)合到雙鏈DNA核酸上，結(jié)合后會發(fā)出比原來增強數(shù)千倍的熒光信號，將此LAMP反應體系放入實時熒光檢測儀器進行反應，通過實時檢測儀的相應軟件可觀察反應進程。該方法可隨時終止試驗，控制反應進程。
　　基于GenBank中金黃色葡萄球菌的nuc基因序列，本研究利用在線引物設(shè)計軟

3、件Primer V4根據(jù)引物設(shè)計原則設(shè)計并選擇與金黃色葡萄球菌的nuc基因相匹配的特異性引物。通過對反應體系中引物的添加量及內(nèi)外引物的比例、Mg2+的添加量、dNTPs的濃度、反應溫度、Bst DNA聚合酶和熒光染料SYBR GreenⅠ的稀釋倍數(shù)等反應條件進行優(yōu)化，建立反應體系如下:
　　FIP和BIP各1.6μM，F(xiàn)3和B3各0.4μM，2mM MgSO4，0.35mM dNTPs，2.5μL10×Bst DNA聚合酶緩沖液，

4、12U的Bst DNA聚合酶，0.5μL DNA模板，0.5μL1∶350稀釋的SYBRGreenⅠ熒光染料，6.5μL滅菌蒸餾水。設(shè)定反應溫度為61℃，反應時間為90min，利用實時熒光監(jiān)測儀并結(jié)合電腦軟件對試驗進程進行實時監(jiān)測，根據(jù)反應進程可隨時終止反應。
　　本研究對8株金黃色葡萄球菌及16株其他食源性致病菌共24株菌株進行特異性試驗，結(jié)果表明只有8株金黃色葡萄球菌菌株的檢測結(jié)果為陽性，其他16株食源性致病菌菌株檢測結(jié)果均為