BCR-ABL擴(kuò)增導(dǎo)致Wnt-β-catenin信號(hào)通路激活與慢性粒細(xì)胞性白血病急變的分子機(jī)制.pdf

1、慢性粒細(xì)胞白血?。–hronic myeloid leukemia, CML）是一種起源于骨髓造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病。bcr-abl融合基因是CML的遺傳學(xué)特征， bcr-abl融合基因轉(zhuǎn)錄并翻譯成具有高酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白，從而激活下游PI3K/Akt、RAS/MAPK、STAT5等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致血細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。慢性期到急變期轉(zhuǎn)變是慢性粒細(xì)胞白血?。?Chronic myeloid leukemia,

2、CML）的致死性進(jìn)展，其根本原因是bcr-abl融合基因的擴(kuò)增及白血病干細(xì)胞（leukemic stem cell，LSC）的產(chǎn)生，而Wnt/β-catenin信號(hào)通路在CML的LSC自我更新中起到重要作用，因此BCR-ABL擴(kuò)增后激活β-catenin通路可能是CML急變的原因之一，但其機(jī)制尚不清楚。
　　目的：研究CML中BCR-ABL擴(kuò)增導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活的分子機(jī)制及其與CML急變之間的關(guān)系，明確β-

3、catenin信號(hào)通路激活是否受BCR-ABL擴(kuò)增激活的PI3K/Akt通路的調(diào)節(jié)，為尋找靶向CML急變的源頭-LSC治療策略提供新思路。
　　方法：⑴采用定量PCR和Western blot檢測(cè)BCR-ABL和β-catenin在CML急變期、慢性期病人骨髓標(biāo)本中的表達(dá)，以及在CML急變期細(xì)胞株及bcr-abl融合基因(P210)轉(zhuǎn)化細(xì)胞株(BaF3-P210、32D-P210)中的表達(dá)情況，了解BCR/ABL擴(kuò)增、PI3K/A

4、kt通路激活與β-catenin激活的初步關(guān)系，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。⑵分別采用三種抑制劑，BCR-ABL酪氨酸激酶抑制劑--甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesylate, IM)， PI3K激酶抑制劑--LY294002及AKT激酶抑制劑--AKTiⅣ，抑制K562細(xì)胞中BCR-ABL/PI3K/AKT通路，通過(guò) Western blot、定量 PCR、免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞中磷酸化β-catenin(p-β-catenin)、磷酸

5、化 GSK-3β(p-GSK-3β)、總β-catenin、總GSK-3β的變化，β-catenin的核漿定位及下游癌基因c-myc，cyclinD1的表達(dá)；體外克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞自我更新能力的改變，放線菌酮處理檢測(cè)β-catenin的蛋白穩(wěn)定性，定量PCR檢測(cè)β-catenin的mRNA水平；并使用PI3K/AKT通路激活劑IGF-1，觀察細(xì)胞中p-β-catenin、總β-catenin的表達(dá)變化，從正反兩方面進(jìn)一步了解BCR-A

6、BL擴(kuò)增在體外激活Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用機(jī)理。⑶構(gòu)建K562-NOD/SCID小鼠的CML模型，觀察抑制劑處理組模型小鼠的疾病潛伏期、一般情況、生存期、外周血中WBC及白血病細(xì)胞的數(shù)量，流式細(xì)胞術(shù)觀察外周血CD45+白血病細(xì)胞的百分率；石蠟切片染色觀察白血病細(xì)胞在肝、脾、肺等組織的侵潤(rùn)情況；免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)模型鼠骨髓及外周血中β-catenin的表達(dá)及核漿分布；并取模型小鼠骨髓的單個(gè)核細(xì)胞構(gòu)建二次移植模型，

7、比較K562細(xì)胞的再次成瘤能力的差異，研究 BCR-ABL擴(kuò)增在 CML小鼠中激活Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用機(jī)理。
　　結(jié)果：①在CML急變期病人中BCR-ABL和β-catenin的基因及蛋白水平都明顯高于慢性期患者，慢粒急變期細(xì)胞株K562及KU812細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)明顯高于其他細(xì)胞株，尤其是在K562細(xì)胞中。與未轉(zhuǎn)化的正常細(xì)胞株比較，轉(zhuǎn)染了bcr/abl融合基因(P210)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞株(BaF

8、3-P210、32D-P210)中β-catenin和磷酸化AKT(p-AKT)的表達(dá)也是增高的。②在慢粒急變期白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞中，應(yīng)用三種抑制劑分別抑制BCR-ABL/PI3K/AKT通路，可使細(xì)胞胞漿及胞核中的β-catenin的蛋白表達(dá)降低，減少GSK-3β的磷酸化，加快β-catenin的降解，減少β-catenin的入核，降低了下游癌基因c-myc，cyclinD1的mRNA及蛋白水平，并使 K562細(xì)胞克隆形成能力下

9、降。而使用 IGF-1激活PI3K/AKT通路，可使p-GSK-3β表達(dá)增加， p-β-catenin減少，總β-catenin及c-myc增加。③應(yīng)用三種抑制劑抑制BCR-ABL/PI3K/AKT通路，明顯延緩了K562細(xì)胞在NOD/SCID小鼠體內(nèi)的植入，延長(zhǎng)了小鼠的發(fā)病時(shí)間及生存期。抑制劑處理組小鼠在體重減輕、外周血白細(xì)胞增高、肝脾腫大、臟器白血病細(xì)胞浸潤(rùn)、其它部位腫瘤發(fā)生等方面都較對(duì)照組有明顯改善。并且小鼠的外周血白血病細(xì)胞、骨

10、髓、脾肺組織中β-catenin的表達(dá)均下降。二次移植實(shí)驗(yàn)提示抑制BCR-ABL/PI3K/Akt的活性，可減弱白血病細(xì)胞的再次成瘤能力，減少CML二次移植模型小鼠外周血及骨髓中白血病細(xì)胞的浸潤(rùn)，使小鼠的生存期延長(zhǎng)。
　　結(jié)論：從體內(nèi)外兩方面證明抑制BCR-ABL/PI3K/AKT通路，可減少GSK-3β的磷酸化，從而降低細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)，使白血病細(xì)胞的自我更新能力下降、致病能力減弱，并可能因此延遲了白血病細(xì)胞向LS