轉(zhuǎn)錄后激活c-Myc調(diào)控慢性髓系白血病細(xì)胞的非Bcr-Abl依賴新機(jī)制研究.pdf

1、目的：慢性髓細(xì)胞白血?。–hronic myeloid leukemia, CML）是Bcr/Abl融合基因?qū)е碌脑煅杉?xì)胞惡性克隆性疾病，針對(duì)異常激活的Bcr/Abl酪氨酸激酶的抑制劑（Tyrosine kinase inhibitors,TKI）目前作為CML的一線用藥在CML治療中取得了極大成功。但是慢性期微小殘留疾病（Minimal residual disease,MRD）的持續(xù)存在，使得CML病人在停藥后近30％復(fù)發(fā)；部分病

2、人出現(xiàn)耐藥且急變期TKI療效差，成為TKI治療的瓶頸。最新進(jìn)展提示c-Myc激活在調(diào)控CML白血病干細(xì)胞（Leukemia stem cells，LSCs）中至關(guān)重要，但其機(jī)制不清。本實(shí)驗(yàn)以CML急變期及慢性期患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞、人慢性髓細(xì)胞白血病急變細(xì)胞系K562為研究對(duì)象，觀察MDM2、c-Myc及miR-29三者在CML急變期及慢性期患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)情況，分析其與臨床特征的關(guān)系；在CML急變細(xì)胞系K562中初步證實(shí)了c-

3、Myc激活受癌基因MDM2轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，并抑制下游腫瘤抑制基因 miR-29的轉(zhuǎn)錄；同時(shí)也進(jìn)一步探究了轉(zhuǎn)錄后激活c-Myc對(duì)CML急變細(xì)胞系K562的增殖、凋亡、細(xì)胞周期及甲磺酸伊馬替尼(Imatinib mesylate，IM)藥物敏感性所產(chǎn)生的影響。
　　方法：Ficoll密度梯度離心法分離 CML急變期及慢性期患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞，按常規(guī)方法凍存，并記錄其臨床資料；RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng) CML急變細(xì)胞系K562，Wes

4、tern Blot檢測(cè)上述細(xì)胞中MDM2、c-Myc蛋白的表達(dá)并分析兩者表達(dá)的相關(guān)性；Real-time RT-PCR檢測(cè)上述細(xì)胞中 MDM2、c-Myc mRNA及miR-29三者的表達(dá)情況并分析其相關(guān)性；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染MDM2表達(dá)質(zhì)粒及MDM2shRNA質(zhì)粒、慢病毒轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染c-Myc shRNA，Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的K562細(xì)胞系中 MDM2、c-Myc蛋白的表達(dá)并分析兩者表達(dá)的相關(guān)性；Real-time RT-

5、PCR檢測(cè)上述細(xì)胞系中 MDM2、c-Myc及 miR-29三者的表達(dá)情況并分析其相關(guān)性；MTT法檢測(cè)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MDM2 shRNA質(zhì)粒48h后K562細(xì)胞系的增殖及轉(zhuǎn)染前后K562細(xì)胞系的IM敏感性；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MDM2 shRNA質(zhì)粒48h后K562細(xì)胞系的凋亡及細(xì)胞周期的變化。
　　結(jié)果：
　　1、在CML急變期患者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞及CML急變細(xì)胞系K562中MDM2、c-Myc的mRNA及蛋白高表達(dá)，在C

6、ML慢性期患者中相對(duì)低表達(dá)，且兩者的表達(dá)有一定的正相關(guān)性；miR-29在CML急變期患者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞及K562細(xì)胞系中低表達(dá)，在CML慢性期患者中相對(duì)高表達(dá)，且與MDM2及c-Myc的表達(dá)存在一定的負(fù)相關(guān)性；
　　2、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MDM2表達(dá)質(zhì)粒后的K562細(xì)胞系與轉(zhuǎn)染對(duì)照載體相比，MDM2蛋白及mRNA表達(dá)明顯升高，c-Myc蛋白表達(dá)明顯升高，mRNA基本不變，miR-29表達(dá)明顯下降；
　　3、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MDM2 sh

7、RNA質(zhì)粒后的K562細(xì)胞系與轉(zhuǎn)染對(duì)照載體相比，MDM2蛋白及mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，c-Myc蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，mRNA基本不變，miR-29表達(dá)明顯升高；
　　4、慢病毒轉(zhuǎn)染c-Myc shRNA后的K562細(xì)胞系與轉(zhuǎn)染對(duì)照載體相比，c-Myc蛋白及mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，MDM2蛋白及mRNA表達(dá)稍有下調(diào)，miR-29表達(dá)明顯升高；5、MTT及流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MDM2shRNA質(zhì)粒后的K562細(xì)胞與轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比

8、，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，IM藥物敏感性也有所提高，細(xì)胞凋亡率升高，但細(xì)胞周期沒(méi)有明顯變化。
　　結(jié)論：癌基因MDM2可調(diào)控c-Myc蛋白表達(dá)，但對(duì)其mRNA表達(dá)無(wú)影響，提示MDM2可能在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)c-Myc基因進(jìn)行調(diào)控,進(jìn)而c-Myc作為轉(zhuǎn)錄因子抑制腫瘤抑制因子miR-29的轉(zhuǎn)錄；干擾MDM2的表達(dá)可在一定程度上抑制CML急變細(xì)胞系K562的增殖，增加其對(duì)IM的敏感性，促進(jìn)K562細(xì)胞的凋亡，但對(duì)細(xì)胞周期沒(méi)有明顯的影響，其機(jī)制可