人t-PA指形區(qū)缺失體乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及細(xì)胞表達(dá)研究.pdf

1、　　本研究以奶牛β-酪蛋白基因調(diào)控區(qū)為指導(dǎo)元件，以人組織型纖溶酶原激活劑指形區(qū)缺失體(t-PA指形區(qū)缺失體)為表達(dá)序列，構(gòu)建了乳腺特異性表達(dá)載體pEBT。轉(zhuǎn)染牛耳成纖維細(xì)胞，篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)株。在載體pEBT的基礎(chǔ)上，加入牛乳腺核基質(zhì)附著區(qū)(BMARs)和人α-絲氨酸蛋白酶抑制劑基因的核基質(zhì)附著區(qū)(HMARs)，構(gòu)建成另外兩個(gè)t-PA指形區(qū)缺失體乳腺特異性表達(dá)載體pBEBT和pHEBT。為利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)牛乳腺生物反應(yīng)器，提供高

2、效表達(dá)t-PA指形區(qū)缺失體的細(xì)胞株。相關(guān)結(jié)果如下：1.通過(guò)RT-PCR技術(shù)成功的從人胎盤組織中擴(kuò)增出長(zhǎng)度為1640bp的人t-PA指形區(qū)缺失體cDNA，其中包含完整的編碼序列。序列分析表明，片段與GenBank中登錄的人t-PA指型區(qū)缺失區(qū)體cDNA序列的同源性為99﹪。在讀碼框內(nèi)，只有三個(gè)堿基發(fā)生點(diǎn)突變。2.利用定向克隆的方法，將t-PA指形區(qū)缺失體表達(dá)序列克隆到初級(jí)乳腺表達(dá)載體pBCP上，然后定向克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-C1中

3、，最終構(gòu)建了t-PA指形區(qū)缺失體乳腺特異性表達(dá)載體pEBT。載體含有抗性基因和綠色熒光蛋白(EGFP)報(bào)告基因，并報(bào)告基因和目的基因表達(dá)為非融合型表達(dá)。3.通過(guò)脂質(zhì)體法將表達(dá)載體pEBT轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的牛耳成纖維細(xì)胞，經(jīng)G418抗性篩選，得到可穩(wěn)定地表達(dá)綠色熒光蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞，但表達(dá)量偏低。4.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增了牛乳腺核基質(zhì)附著區(qū)，全長(zhǎng)1190bp。。5.將牛乳腺核基質(zhì)附著區(qū)(BMARs)定向克隆至pEGFP-C1載體中EGFP的下游，

4、構(gòu)成重組載體pBE。并在牛乳腺核基質(zhì)附著區(qū)的上游引入終止密碼子TAA，確保表達(dá)的EGFP為非融合蛋白。將pBE載體轉(zhuǎn)染分離培養(yǎng)的牛耳成纖維細(xì)胞，經(jīng)G418抗性篩選后得到的穩(wěn)定克隆在熒光顯微鏡下觀察，表明BMARs確實(shí)可提高基因的表達(dá)效率。6.以重組表達(dá)載體pBE和pHE(pEGFP-Cl-HMARs)為基礎(chǔ)構(gòu)建了t-PA指形區(qū)缺失體乳腺特異性表達(dá)載體pBEBT和pHEBT。目的是通過(guò)核基質(zhì)附著區(qū)克服位置效應(yīng)，轉(zhuǎn)染后可獲得高效表達(dá)株。7.