SPC24基因在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及功能的初步研究.pdf

1、目的：作為核分裂周期80（nuclear division cycle80,Ndc80）動(dòng)點(diǎn)蛋白復(fù)合物的核心組分之一，SPC24基因參與并調(diào)控細(xì)胞有絲分裂的重大分子事件，例如：動(dòng)點(diǎn)-微管的精準(zhǔn)耦合、染色體的正確列隊(duì)、染色體的均等分裂等。然而，SPC24基因與原發(fā)性肝細(xì)胞癌（肝癌）（Hepatocellular carcinoma, HCC）發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移之間的關(guān)聯(lián)性仍然未知。本文旨在研究SPC24基因在肝癌組織中的表達(dá)水平，并且

2、深入地分析SPC24基因的表達(dá)與肝癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，為尋找新的肝癌診斷指標(biāo)以及潛在的治療靶點(diǎn)提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.本研究選取2001年11月至2007年4月期間于桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行根治性手術(shù)切除的肝癌患者。選取了212例肝癌患者的癌組織及其相應(yīng)的癌旁肝組織樣本（adjacent normal liver tissues，ANLT），9例正常肝組織（選自肝血管瘤患者）樣本。
　　2.首先

3、選用普通RT-PCR方法檢測(cè)20對(duì)肝癌組織和相應(yīng)癌旁組織，以及9例正常肝組織樣本中SPC24 mRNA的表達(dá)情況；進(jìn)一步采用Real-time PCR分析212對(duì)肝癌及相應(yīng)癌旁組織樣本中SPC24 mRNA的表達(dá)水平。
　　3.應(yīng)用免疫組織化學(xué)(Immunohistoehemistry, IHC)方法檢測(cè)69對(duì)肝癌組織和相應(yīng)癌旁組織，以及9例正常肝組織樣本中SPC24蛋白的表達(dá)模式；并且采用Western-blot實(shí)驗(yàn)分析40對(duì)肝

4、癌組織和相應(yīng)癌旁組織，以及9例正常肝組織樣本中SPC24蛋白的表達(dá)水平。
　　4. RT-PCR方法檢測(cè)12種人肝癌細(xì)胞系（ Hep3B, SK-hep1, Huh7, SMMC7721, MHCC97L, MHCC97H, PLC, HepG2, QGY7703, BEL7402, BEL7404,BEL7405）和1種正常肝細(xì)胞系（LO2）中SPC24 mRNA的表達(dá)水平，篩選出適用于細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的肝癌細(xì)胞系。
　　5

5、.應(yīng)用 Whitehead公司的在線設(shè)計(jì)軟件（http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/）設(shè)計(jì)3對(duì)特異性靶向SPC24基因的小干擾RNA（Small interfering RNA, siRNA）序列及1對(duì)陰性對(duì)照序列，并由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞系SMMC7721和HepG2細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合率達(dá)到60-80％時(shí)，將針對(duì)SPC24基因的特異性siRNA轉(zhuǎn)染至SMM

6、C7721和HepG2肝癌細(xì)胞，分別提取轉(zhuǎn)染后48 h、72 h的細(xì)胞總 RNA及蛋白。并采用 RT-PCR及Western-blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。
　　6.采用沉默肝癌細(xì)胞內(nèi)源性SPC24效果最佳的siRNA-2進(jìn)行后序的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。SPC24 siRNA-2轉(zhuǎn)染至SMMC7721和HepG2肝癌細(xì)胞后，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)CCK-8試劑盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）分析肝癌細(xì)胞增殖及粘附比例的變化

7、。
　　7. SPC24 siRNA-2轉(zhuǎn)染至SMMC7721和HepG2肝癌細(xì)胞后，采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分析肝癌細(xì)胞侵襲能力的變化。
　　8. SPC24 siRNA-2轉(zhuǎn)染至SMMC7721和HepG2肝癌細(xì)胞后，選取Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞中cleaved caspase-3表達(dá)量的變化，分析肝癌細(xì)胞凋亡能力的變化。
　　結(jié)果：
　　1. RT-PCR檢測(cè)的20對(duì)樣本中，與相應(yīng)癌旁

8、組織比較，有18例（90％）肝癌樣本中動(dòng)點(diǎn)相關(guān)基因SPC24 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，而在9例正常肝組織中SPC24mRNA表達(dá)量十分微弱。Real time PCR檢測(cè)的212對(duì)樣本中，有155例（73.1%）肝癌樣本中SPC24 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，而僅有57例（26.9%）SPC24 mRNA表達(dá)量呈下調(diào)狀態(tài)。肝癌組織中SPC24 mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織(mean± SD,1.123±0.072和0.350±0.036,

9、p<0.0001)。
　　2. IHC檢測(cè)69對(duì)HCC樣本中SPC24蛋白水平情況，結(jié)果顯示：有51例（73.90%）肝癌患者組織中的SPC24蛋白水平明顯高于相應(yīng)的癌旁組織，而僅有22例（31.90%）癌旁肝組織中SPC24蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)水平，同時(shí)，在9例正常肝組織中，SPC24蛋白水平呈陰性。Western-blot檢測(cè)的40對(duì)樣本中SPC24蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，結(jié)果表明：有35例（87.50%）肝癌患者組織中的SPC24蛋白水

10、平明顯高于相對(duì)應(yīng)的癌旁組織，而在9例正常肝組織中，SPC24蛋白水平極低，或檢測(cè)不到。
　　3.RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：SPC24 mRNA在人肝癌細(xì)胞系Hep3B，Huh7， SMMC7721，MHCC97H，PLC，HepG2，QGY7703，BEL7404，BEL7405中表達(dá)明顯上調(diào)，而在LO2，MHCC97L，SK-hep1，BEL7402等細(xì)胞系中則表達(dá)相對(duì)較弱。
　　4.RT-PCR和Western Blot

11、ting檢測(cè)結(jié)果顯示：用針對(duì)SPC24基因的特異性siRNAs干擾人肝癌細(xì)胞系SMMC7721和HepG2后，肝癌細(xì)胞中內(nèi)源性SPC24mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯降低。并且，SPC24 siRNA-2的靶向沉默效果最佳，所以我們選用SPC24 siRNA-2進(jìn)行后序的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
　　5.與siRNA陰性對(duì)照組比較，SPC24 siRNA-2顯著抑制人肝癌細(xì)胞系SMMC7721和HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)能力、粘附能力、和侵襲能力

12、。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染SPC24 siRNA-2的肝癌細(xì)胞中cleaved caspase-3表達(dá)量明顯上調(diào)，表明沉默肝癌細(xì)胞內(nèi)源性SPC24基因后可引發(fā)細(xì)胞凋亡事件。
　　6.相關(guān)性分析結(jié)果顯示：肝癌組織中SPC24 mRNA的高表達(dá)水平與血清甲胎蛋白水平（alpha-fetoprotein, AFP）（>200 ng/ml）、較大的腫瘤、多發(fā)腫瘤、以及巴塞羅那臨床肝癌分期（barcelona clinic li

13、ver cancer staging classification，BCLC）為B-C期等因素呈正相關(guān)（p<0.05）。
　　7.采用Kaplan-Meier曲線評(píng)估，我們發(fā)現(xiàn)，與低表達(dá)SPC24的患者比較，高表達(dá)SPC24的患者術(shù)后無瘤生存時(shí)間（disease-free survival, DFS）(p<0.001)和總生存時(shí)間（overall survival, OS）(p=0.001)更短。多因素分析顯示，SPC24表達(dá)上調(diào)