基因芯片技術(shù)在成年男性精子基因表達(dá)譜研究中的應(yīng)用.pdf

1、不孕不育是全世界關(guān)注的課題。目前每100對(duì)已婚夫婦中，就有10對(duì)夫婦存在不孕不育問(wèn)題。其中男性因素占到了50％。也就是說(shuō)，男性精子質(zhì)量不佳，己影響到人類(lèi)的繁衍生息。 該文把精子中具有編碼功能的序列作為重點(diǎn)，把精子的基因表達(dá)譜作為研究對(duì)象。 要研究精子的基因表達(dá)，首要的問(wèn)題是提取到精子中表達(dá)的RNA。精子與體細(xì)胞不同，是單倍體細(xì)胞，處于分化的終末階段，因此，以前人們一直認(rèn)為精子中無(wú)基因表達(dá)，精子基因分子生物學(xué)的研究也一直沒(méi)

2、有深入開(kāi)展。直到最近幾年，KramerJ等人首先報(bào)道了在精子內(nèi)檢測(cè)到了RNA的表達(dá)，此后MullerD等人先后改進(jìn)了異硫氫酸胍/有機(jī)溶劑的抽提方法，并排除了各種可能造成DNA污染因素，自成人的精子中分離到了RNA，才證實(shí)了成熟精子中確實(shí)存在RNA的表達(dá)。隨著對(duì)精子分子生物學(xué)研究的不斷深入，精子中有基因表達(dá)也越來(lái)越得到人們的認(rèn)同，如頂體中的水解蛋白酶(透明質(zhì)酸酶，頂體素)和磷脂酶，線粒體中的琥珀酸脫氫酶，此外還有Na+、K+-ATP酶、酪

3、氨酸蛋白激酶、尿激酶、乳酸脫氫酶等等。這些發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)激發(fā)了人們進(jìn)一步研究精子基因表達(dá)的濃厚興趣。 提取細(xì)胞或組織中的RNA，異硫氰酸胍法一直是傳統(tǒng)而經(jīng)典的方法，對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞和組織都能得到良好的結(jié)果，但在提取精子中的RNA時(shí)，效果并不理想。 精子是單倍體細(xì)胞，比之體細(xì)胞，RNA的表達(dá)數(shù)相對(duì)少。作為分化末期狀態(tài)細(xì)胞，RNA的表達(dá)量可能也有所降低，所以總體而言，精子中的RNA量較正常體細(xì)胞低得多。 針對(duì)這種特殊的實(shí)驗(yàn)

4、材料，該實(shí)驗(yàn)對(duì)RNA的提取程序進(jìn)行了探索。選擇了QAGEN公司開(kāi)發(fā)的、針對(duì)小樣品量的RNA提取試劑盒——RNeasyMiniKit，來(lái)提取成年男性活力正常的精子RNA，取得了良好的效果。 對(duì)提取到的RNA在進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄前需進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，以確保沒(méi)有基因組DNA污染。應(yīng)用常規(guī)的凝膠電泳檢測(cè)提取到的少量的精子RNA，無(wú)法在電泳結(jié)果中看到RNA中的三條核糖體RNA條帶，也無(wú)法根據(jù)常規(guī)的條帶間的灰度比值，來(lái)判斷RNA有無(wú)降解或存在DNA污染

5、。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，該文應(yīng)用了微流體芯片高壓凝膠電泳進(jìn)行了質(zhì)量檢測(cè)。在極少量的上樣檢測(cè)中(25ng)，發(fā)現(xiàn)了RNA中的三個(gè)核糖體RNA條帶，但與正常體細(xì)胞的RNA電泳圖譜不一致。在缺乏標(biāo)準(zhǔn)判斷指標(biāo)的前提下，根據(jù)重復(fù)多次(13次)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提出了精子RNA電泳圖譜的基本形狀，及精子RNA質(zhì)量評(píng)價(jià)的基本標(biāo)準(zhǔn)。 進(jìn)而，該文將經(jīng)過(guò)質(zhì)量檢驗(yàn)的精子RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用馬文麗、鄭文嶺教授創(chuàng)建的限制性顯示技術(shù)，對(duì)cDNA進(jìn)行了限制性酶切、

6、加通用接頭，用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，3，端延伸一個(gè)堿基的通用引物為分組引物進(jìn)行了十組PCR分組擴(kuò)增，并將十組PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌，經(jīng)涂板、挑克隆、鑒定、提取陽(yáng)性質(zhì)粒等操作，收集到了560個(gè)精子cDNA的片段，編號(hào)索引后-20℃保存?zhèn)溆谩?將質(zhì)粒中保存的精子cDNA片段，根據(jù)質(zhì)粒上的序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增插入的精子cDNA片段。上述片段擴(kuò)增芳達(dá)到足夠量后(2μg)用異丙醇純化，純化產(chǎn)物重溶于Milli-Q超純水

7、中，取出適量，加入50％DMSO，調(diào)整濃度為300ng/μl，在Corning的玻片上，以3-磷酸甘油醛(GAPDH)為陽(yáng)性對(duì)照，HIV基因片段為陰性對(duì)照，50％二甲基亞砜(DMSO)為空白對(duì)照，每個(gè)探針重復(fù)打印三次，制作了精子表達(dá)譜基因芯片。 應(yīng)用自制的精子cDNA芯片進(jìn)行了兩個(gè)方面的研究。①驗(yàn)證該文收集的精子cDNA探針的準(zhǔn)確性和可信性；②對(duì)精子的基因表達(dá)進(jìn)行了初步的研究。精子樣品按上述同樣的方法和操作程序進(jìn)行限制性顯示實(shí)驗(yàn)

8、操作，但在cDNA片段的兩端連接上了與探針序列不一樣的通用接頭2，再用相應(yīng)的通用引物2擴(kuò)增，避免雜交時(shí)，探針和待雜交樣品間都具有大約40bp的同源性片段，從而對(duì)雜交結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響。經(jīng)此法制備的精子cDNA片段，用Cy3熒光物質(zhì)標(biāo)記后，與36×34的芯片陣列進(jìn)行了單色雜交，雜交結(jié)果證實(shí)該文收集的精子cDNA探針具有較好的準(zhǔn)確性和可信性，可進(jìn)行進(jìn)一步的雜交實(shí)驗(yàn)和分析。進(jìn)一步收集精子樣品和人的淋巴細(xì)胞，采用與單色雜交相同的方法和程序，制

9、備了Cy3標(biāo)記的精子cDNA片段和Cy5標(biāo)記的人淋巴細(xì)胞cDNA片段，與42×40的芯片陣列雜交。雜交結(jié)果提示，精子中已有大量的基因表達(dá)，并且在精子中與基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及蛋白質(zhì)的翻譯和降解等相關(guān)的基因表達(dá)基本屬于無(wú)差異表達(dá)類(lèi)型或低表達(dá)類(lèi)型，而與精子發(fā)生相關(guān)的基因、精子本身的特異性抗原等基因則顯著高表達(dá)，如人精子相關(guān)抗原4、精子發(fā)生相關(guān)基因2、DAZ3基因等。與能量生成密切相關(guān)的基因，如糖酵解相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，而與氧化磷酸化相關(guān)

10、的基因則表達(dá)下調(diào)，這與獲能前的精子主要依賴(lài)無(wú)氧酵解供能的生理特點(diǎn)相一致。此外，在表達(dá)的基因片段中，有2個(gè)探針與人直腸腺癌cDNA消減文庫(kù)中的基因高度同源，但功能未知，還有一些基因探針與NCBI的NR和EST數(shù)據(jù)庫(kù)比較，都未發(fā)現(xiàn)有同源性片段，推測(cè)是精子中特異表達(dá)的基因，已作為新EST向GeneBank進(jìn)行了提交。 為進(jìn)一步擴(kuò)大研究精子細(xì)胞的基因表達(dá)譜，該研究應(yīng)用了人全基因組寡核苷酸芯片(AgilentHuman1B基因芯片)，對(duì)正

11、常的睪丸組織與射精精子，以及正常與無(wú)活力射精精子的基因表達(dá)譜進(jìn)行了研究。采用cRNA線性標(biāo)記擴(kuò)增技術(shù)對(duì)精子的mRNA進(jìn)行線性擴(kuò)增和標(biāo)記。雜交后該文建立了正常精子基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在待測(cè)的21073個(gè)基因中，正常精子兩次雜交共同檢測(cè)到表達(dá)的基因僅有2157個(gè)，包括目前已知的與精子的發(fā)生和活力相關(guān)的基因22個(gè)。精子基因表達(dá)譜的建立展現(xiàn)了經(jīng)射精獲得的精子內(nèi)表達(dá)mRNA的全貌，為我們進(jìn)一步研究精子內(nèi)所進(jìn)行的各種分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程奠定了基礎(chǔ)

12、。正常精子與正常睪丸組織分別提取總RNA，純化為mRNA后經(jīng)cRNA線性標(biāo)記擴(kuò)增，并與人全基因組寡核苷酸芯片雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常精子相對(duì)于睪丸組織而言共有67個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，包括16個(gè)目前已知的與發(fā)育相關(guān)的基因，14個(gè)與精子發(fā)生、成熟及活力相關(guān)的基因等如TCFL5、HIST1H1T基因等。除此之外，這些表達(dá)上調(diào)的基因按照功能分類(lèi)，還包括14個(gè)與配子發(fā)生相關(guān)的基因，13個(gè)與蛋白代謝及修飾相關(guān)的基因，11個(gè)與核苷、核苷酸、核酸代謝相關(guān)的基因，

13、10個(gè)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因，8個(gè)與蛋白修飾相關(guān)的基因，6個(gè)與蛋白磷酸化相關(guān)的基因和6個(gè)與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大相關(guān)的基因等。這些基因的篩出，為進(jìn)一步研究在精子成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用的基因提供了依據(jù)。 正常精子與活力不足精子的基因表達(dá)差異分析發(fā)現(xiàn)活力不足的精子中表達(dá)上調(diào)的基因有69個(gè)，包括目前已知的與精子發(fā)育及活力明確相關(guān)的C1QBP、SEMG2、ABP1、SPATA5、SEMG1、USP25、CREM、GRP58、NM139073.

14、1共9個(gè)基因。表達(dá)下調(diào)的基因有116個(gè)，包括目前已知與精子發(fā)育及活力明確相關(guān)的基因MGC26706、CATSPER1、ODF1、PRKAR2A、ROPN1、RSHL1、CATSPER2、AF053356CDS3、TEKT3、GAPDS、TEKT2、DJ473B4共12個(gè)。篩選出的其余的差異基因初步認(rèn)為都與精子活力不足的發(fā)生有關(guān)，當(dāng)然確切的結(jié)論尚需進(jìn)一步的研究確定。 綜上所述，該文通過(guò)提取精子的RNA，收集精子cDNA芯片探針，自