顯微切割聯(lián)合甲基化DNA免疫共沉淀芯片技術(shù)初步建立前列腺腺癌基因組異常甲基化譜.pdf

1、目的：本研究采用激光捕獲顯微切割技術(shù)聯(lián)合甲基化DNA免疫共沉淀芯片技術(shù)建立完整的前列腺腺癌全基因組異常甲基化譜，為前列腺腺癌相關(guān)基因的甲基化研究奠定基礎(chǔ)，為新的前列腺腺癌相關(guān)基因的克隆、定位和鑒定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：選取廣東省人民醫(yī)院泌尿外科前列腺癌根治術(shù)患者的前列腺組織作為研究對(duì)象。納入符合標(biāo)準(zhǔn)的前列腺腺癌3例。采用激光捕獲顯微切割技術(shù)從前列腺腺癌組織中捕獲均一同質(zhì)的前列腺腺癌腺體細(xì)胞和癌旁腺體細(xì)胞，并分別提取基因組DNA

2、，利用甲基化DNA免疫共沉淀技術(shù)將各樣本的甲基化DNA片段共沉淀下來(lái)，與本底對(duì)照分別標(biāo)記Cy3和Cy5熒光，然后上樣于NimbleGen甲基化芯片（3x720K，覆蓋27,728CpG島和22,532啟動(dòng)子）進(jìn)行雜交。通過(guò)對(duì)這些樣本基因組CpG島和啟動(dòng)子區(qū)甲基化譜的分析，比較前列腺腺癌和癌旁腺體的甲基化差異，篩選出一組可能參與前列腺腺癌發(fā)生的甲基化基因。根據(jù)差異甲基化區(qū)域的PeakScore值，挑選出甲基化最顯著的前10位基因，上傳至D

3、AVID在線軟件，進(jìn)行GO分析和Pathway分析。
　　結(jié)果：激光捕獲顯微切割捕獲的樣本DNA在瓊脂糖凝膠電泳圖中顯示清晰，完整，可用于甲基化DNA免疫共沉淀芯片雜交。前列腺腺癌和癌旁腺體分別有7459個(gè)和7182個(gè)啟動(dòng)子發(fā)生甲基化，甲基化發(fā)生率分別為33.1％和31.8%。，其中65.6%為高CpG密度啟動(dòng)子區(qū)。前列腺腺癌和癌旁腺體分別有9961個(gè)和8768個(gè)CpG島發(fā)生甲基化，甲基化發(fā)生率分別為35.9%和31.6%，其中6

4、9.4%為啟動(dòng)子區(qū)CpG島區(qū)。前列腺腺癌與癌旁腺體存在差異甲基化的啟動(dòng)子有468個(gè)，其中超甲基化273個(gè)，去甲基化195個(gè)。前列腺腺癌與癌旁腺體存在差異甲基化的CpG島有652個(gè)，其中超甲基化434個(gè)，去甲基化219個(gè)，生物信息學(xué)分析提示這些基因涉及多個(gè)分子功能、生物過(guò)程和信號(hào)通路。本研究共篩選出11個(gè)前列腺腺癌超甲基化最顯著的基因，它們分別是ARRDC4，ARHGAP20，MCCC2，SHROOM4，SHISA2，NDNL2，ZAP7

5、0，C8ORFK29，TMEM54，ZNF592，JMY，其中ZAP70參與了16個(gè)GO注釋的生物功能，56種疾病的發(fā)生和發(fā)展，61個(gè)蛋白間的相互作用，可能在前列腺腺癌發(fā)生發(fā)展中存在重要的意義。
　　結(jié)論：激光捕獲顯微切割技術(shù)是有效獲取組織切片DNA樣本，純化細(xì)胞成分，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性和特異性的方法。前列腺腺癌和癌旁腺體之間存在大量啟動(dòng)子和CpG島超甲基化和去甲基化改變，前列腺腺癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的表觀遺傳學(xué)過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)篩選出1