高甲基化抑癌基因HIC1在前列腺癌發(fā)展中作用.pdf

1、目的:
　　探討高甲基化抑癌基因HIC1在前列腺癌發(fā)展中的作用及分子機(jī)制。
　　方法:
　　(1)采用甲基化特異性PCR(MSP),亞硫酸鹽測序PCR(BSP)技術(shù),對前列腺癌細(xì)胞和臨床標(biāo)本進(jìn)行HIC1啟動子甲基化分析,并分析經(jīng)5-Aza-CdR處理前列腺癌細(xì)胞后的HIC1啟動子甲基化狀態(tài);采用RT-PCR和Westem blot分析前列腺癌細(xì)胞中HIC1表達(dá)水平。
　　(2)建立HIC1過表達(dá)前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C

2、3HIC1、C4-2BHIC1和相應(yīng)對照株P(guān)C3GFP、C4-2BGFP,采用流式細(xì)胞儀和體外細(xì)胞侵襲等功能實驗檢測前列腺癌的體外侵襲轉(zhuǎn)移能力。在SCIDd小鼠體內(nèi)注射PC3HIC1、C4-2BHIC1與對照株,分析形成腫瘤大小;進(jìn)行小鼠骨X成像、大腿脛骨TRAP染色和小動物L(fēng)uciferase活體成像,分析HIC1過表達(dá)后對前列腺癌形成和轉(zhuǎn)移能力影響的差異。
　　(3)對細(xì)胞株P(guān)C3HIC1、C4-2BHIC1和對照株進(jìn)行基因芯

3、片實驗,發(fā)現(xiàn)受HIC1調(diào)控的差異基因表達(dá)譜;采mRT-qPCR、Western blot和流式細(xì)胞儀分別對潛在的下游靶基因CXCR-7、E-cadherin、Vimentin和Snail的表達(dá)變化進(jìn)行驗證。進(jìn)行Luciferase報告基因和染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗,分析在前列腺癌細(xì)胞PC3和C4-2B中,HIC1是否和CXCR7的啟動子區(qū)域進(jìn)行結(jié)合;采用免疫組化實驗(IHC)分析注射前列腺癌細(xì)胞的SCID小鼠成瘤組織,組織芯片實

4、驗分析前列腺癌臨床組織標(biāo)本,驗證HIC1是否抑制了CXCR7的表達(dá):使用Westernblot和流式細(xì)胞儀分析用5-Aza-cdR處理PC3和C4-2B細(xì)胞后,HIC1和CXCR7的表達(dá)。進(jìn)行Westem blot實驗分析PC3HIC1、C4-2BHIC1細(xì)胞與對照株,IHC分析注射前列腺癌細(xì)胞的SCID小鼠的成瘤組織,驗證HIC1過表達(dá)后與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchyrmal transition,EMT)有

5、關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　(1)使用在線分析軟件Methprimer預(yù)測HIC1基因1亞型轉(zhuǎn)錄起始點上游-1,000bp區(qū)域內(nèi)存在3個CpG島。進(jìn)行MSP和BSP測序,發(fā)現(xiàn)在PC3和C4-2B細(xì)胞中,HIC1啟動子存在高度甲基化,而在正常前列腺上皮細(xì)胞PrEC中,HIC1啟動子甲基化程度很低;檢測36例人前列腺癌實體瘤和36例人前列腺正常穿刺組織,發(fā)現(xiàn)HIC1甲基化比例分別是80.3％和31.56％,有明顯差異;

6、用5-Aza-CdR處理前列腺癌細(xì)胞株后,發(fā)現(xiàn)HIC1啟動子甲基化明顯降低,未甲基化趨勢上升,而HIC1轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)。
　　(2)PC3HIC1、C4-2BHIC1與對照株比較,應(yīng)用流式細(xì)胞儀和體外細(xì)胞侵襲等功能實驗,發(fā)現(xiàn)生長速度明顯減慢,凋亡率明顯增高,細(xì)胞遷移能力明顯下降,侵襲功能受到顯著抑制;體外成瘤實驗發(fā)現(xiàn)SCID小鼠成瘤能力降低。PC3HIC1與對照株比較,X成像和TRAP染色結(jié)果顯示骨損毀程度顯著減弱,

7、小動物L(fēng)uciferase活體成像顯示骨轉(zhuǎn)移功能明顯減弱。
　　(3)PC3HIC1、C4-2BHIC1。分別與對照株比較,進(jìn)行基因芯片實驗,發(fā)現(xiàn)一些下游基因CXCR7、Vimentin和Snail表達(dá)受到明顯抑制,而E-Cadherin等基因上調(diào)表達(dá)顯著;通過RT-qPCR,Western blot和流式細(xì)胞儀發(fā)現(xiàn)除CXCR7被下調(diào)表達(dá)外,與EMT有關(guān)的信號通路蛋白的表達(dá)發(fā)生了改變。深入采用Luciferase報告基因和ChIP

8、實驗,證實在前列腺癌細(xì)胞中,HIC1與CXCR7啟動子發(fā)生了結(jié)合,抑制了CXCR7活性;在CXCR7啟動子中突變其潛在的結(jié)合位點(HIC1應(yīng)答元件,HiRE),HIC1介導(dǎo)的抑制性顯著降低。進(jìn)行IHC分析注射前列腺癌細(xì)胞的SCID小鼠的成瘤組織,組織芯片實驗分析前列腺癌組織,驗證了HIC1抑制了CXCR7表達(dá);采用Western blot和流式細(xì)胞儀分析用5-Aza-cdR處理后的PC3和C4-2B細(xì)胞,恢復(fù)HIC1表達(dá)顯著,抑制了CX

9、CR7的表達(dá)水平。進(jìn)行Westem blot實驗分析PC3HIC1、C4-2BHIC1細(xì)胞與對照株,發(fā)現(xiàn)HIC1過表達(dá)后,E-Cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)發(fā)生改變,p-AKT(Ser473)和Snail蛋白表達(dá)下調(diào)。IHC分析驗證HIC1過表達(dá)后,E-Cadherin蛋白表達(dá)上調(diào),Vimentin蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　(1)在前列腺癌中,抑癌基因HIC1的啟動子存在高度甲基化,導(dǎo)致HIC1表達(dá)被沉默

10、或下調(diào)。
　　(2)恢復(fù)HIC1表達(dá),顯著抑制前列腺癌細(xì)胞在體外增殖、遷移、轉(zhuǎn)移能力和體內(nèi)成瘤、骨轉(zhuǎn)移和骨損傷。
　　(3)CXCR7是HIC1調(diào)控的重要下游靶基因,HIC1蛋白與CXCR7啟動子結(jié)合,特異性介導(dǎo)對CXCR7的抑制作用。在前列腺癌中,HIC1啟動子高度甲基化使其表達(dá)下調(diào),降低了對CXCR7的抑制作用,可能在前列腺癌的發(fā)展中發(fā)揮作用。
　　(4)HIC1可能介導(dǎo)EMT的發(fā)生,與前列腺癌發(fā)展存在相關(guān)性。