轉(zhuǎn)錄因子KLF9在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的功能研究.pdf

1、目的:以前列腺癌細(xì)胞LNCaP、PC3、DU145為研究對(duì)象，并建立前列腺癌細(xì)胞小鼠荷瘤模型，檢測(cè)KLF9基因在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況及其對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響，并初步探討其影響前列腺癌發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制。
　　方法:在研究中，我們用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡法(WesternBlot)檢測(cè)KLF9基因在抗雄藥氟他胺(flutamide)在去雄誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞凋亡過程中的變化，以及KLF9在不同前

2、列腺（癌）細(xì)胞系中的表達(dá)情況。我們構(gòu)建了攜帶有四環(huán)素可調(diào)控(tetracycline-on，Tet-on)基因表達(dá)系統(tǒng)的真核表達(dá)載體pTRIPZ-KLF9，用慢病毒感染的方法導(dǎo)入人前列腺癌細(xì)胞系PC3和DU145中，并在強(qiáng)力霉素(doxycycline，Dox)的誘導(dǎo)下過表達(dá)KLF9，分別采用MTT法、克隆形成實(shí)驗(yàn)、FACS法、TUNEL染色及免疫組化(IHC)檢測(cè)KLF9過表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響;用構(gòu)建的pTRI

3、PZ-KLF9和陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PC3或LNCaP細(xì)胞接種于小鼠皮下，觀察轉(zhuǎn)染了各質(zhì)粒的PC3或LNCaP細(xì)胞在小鼠體內(nèi)成瘤率、瘤體生長(zhǎng)速度以及平均腫瘤體積等方面的變化。并且用Western Blot檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白的變化情況以及可能的機(jī)制的變化情況，并對(duì)涉及機(jī)制的可能蛋白做了恢復(fù)實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果:在氟他胺抗雄誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞發(fā)生凋亡的過程中，可誘導(dǎo)KLF9的表達(dá)，且具有隨時(shí)間變化的遞增關(guān)系;敲除內(nèi)源性的KLF9基因可以部分

4、降低氟他胺對(duì)LNCaP細(xì)胞造成的生長(zhǎng)抑制。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與非腫瘤細(xì)胞(RWPE-1、BPH1)相比，KLF9在前列腺癌細(xì)胞系中是低表達(dá)的，尤其是在惡性程度更高的雄激素非依賴性細(xì)胞系(PC3、DU145、C4-2B)中表達(dá)水平更低。過表達(dá)KLF9能顯著抑制前列腺癌PC3和DU145細(xì)胞的增殖及克隆形成能力(P＜0.001)，并能明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(P＜0.001);且使細(xì)胞周期被阻滯在G2/M期。在KLF9過表達(dá)抑制細(xì)胞增殖并且誘導(dǎo)凋亡的過程

5、中，Western Blot及IHC實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抗凋亡相關(guān)蛋白BCL2、Bcl-xl的表達(dá)水平降低(P＜0.01)，凋亡相關(guān)蛋白CleavedCasspase3、Cleaved PARP的表達(dá)水平明顯升高。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，接種pTRIPZ-KLF9組的小鼠腫瘤成瘤率下降（P＜0.01），小鼠瘤體生長(zhǎng)速度明顯慢于對(duì)照組(P＜0.001)，實(shí)驗(yàn)終止時(shí)，腫瘤平均體積明顯小于對(duì)照組(P＜0.001)。在機(jī)制方面，KLF9過表達(dá)可抑制AKT的活化

6、，同時(shí)也抑制AKT下游蛋白mTOR的活化;AKT過表達(dá)之后，可以部分恢復(fù)由KLF9誘導(dǎo)引起的對(duì)前列腺癌細(xì)胞PC3、DU145的生長(zhǎng)抑制及細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論:1）轉(zhuǎn)錄因子KLF9在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)低于其在相應(yīng)的非腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)量;2）在抗雄藥物氟他胺誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞發(fā)生凋亡的過程中，KLF9基因的表達(dá)上調(diào);3）在體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，KLF9基因過表達(dá)后可顯著地誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制前列腺癌的生長(zhǎng)及體內(nèi)成瘤;其可能