HIC1甲基化調(diào)控HIC1-SIRT1通路在慢性胰腺炎惡性轉(zhuǎn)化中的作用研究.pdf

1、背景及目的:慢性胰腺炎是胰腺癌發(fā)生的高危因素,慢性炎癥組織微環(huán)境改變可以誘導(dǎo)基因表觀遺傳學改變。前期研究發(fā)現(xiàn) SIRT1可以促進胰腺癌的發(fā)生,但是對其調(diào)控機制尚未深入研究。本研究旨在探討 HIC1基因啟動子甲基化及HIC1/SIRT1表達在慢性胰腺炎及胰腺癌發(fā)生中的作用。
　　研究方法:應(yīng)用甲基化特異性 PCR檢測正常胰腺組織、慢性胰腺炎組織及胰腺癌組織中HIC1啟動子 CpG島的甲基化水平,比較 HIC1甲基化與胰腺癌臨床病理學

2、特征之間的關(guān)系;用免疫組織化學染色及實時熒光定量 PCR法檢測臨床標本中HIC1蛋白及SIRT1蛋白的表達,比較 HIC1和SIRT1表達的相關(guān)性。檢測胰腺癌細胞系 PANC-1、BXPC-3、ASPC-1中HIC1基因啟動子甲基化水平。通過去甲基化試劑5-aza-dC處理胰腺癌細胞系,誘導(dǎo) HIC1基因啟動子去甲基化。利用western blot檢測5-aza-dC處理后胰腺癌細胞系中HIC1及SIRT1蛋白表達情況,同時用MTT法繪

3、制細胞生長曲線,β半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老狀態(tài),流式細胞學技術(shù)檢測細胞周期的及細胞凋亡的改變。在 PANC-1細胞系中轉(zhuǎn)染 pCDNA3FlagHIC1真核表達質(zhì)粒,通過 G418篩選構(gòu)建 HIC1高表達的PANC-1細胞。應(yīng)用western blot檢測 HIC1蛋白高表達對 SIRT1表達的影響,以及對細胞增殖、周期、凋亡及衰老的作用。此外,在 HIC1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的PANC-1細胞中,通過瞬時轉(zhuǎn)染 pCDNA3FlagSIRT1再次

4、上調(diào) SIRT1的表達,觀察對細胞增殖、周期、凋亡及衰老的調(diào)控作用。為了初步探討 HIC1/SIRT1對細胞生物學的影響的分子機制,在5-aza-dC處理的PANC-1、BXPC-3、ASPC-1細胞中和利用外源性基因表達調(diào)控 HIC1/SIRT1通路的PANC-1細胞中,用western blot法檢測乙?；?P53、總 P53、p21WAF1/CIP1蛋白的表達情況。
　　研究結(jié)果:HIC1啟動子甲基化陽性率在正常胰腺組織、慢

5、性胰腺炎組織及胰腺癌組織中分別為11.4％、47.5％、79.3％,統(tǒng)計學顯示 HIC1啟動子甲基化水平在慢性胰腺炎和胰腺癌組織中逐漸增加(P<0.01)。HIC1啟動子甲基化水平與患者的年齡、腫瘤 TNM分期相關(guān)(P<0.01),與腫瘤直徑、腫瘤組織分化程度無關(guān)(P>0.05)。免疫組織化學染色顯示 HIC1在正常胰腺、慢性胰腺炎及胰腺癌中表達陽性率分別為91.4％,62.5％,37.5％,統(tǒng)計學顯示 HIC1蛋白表達在慢性胰腺炎和胰

6、腺癌組織中逐漸下降(P<0.01)。SIRT1在正常胰腺、慢性胰腺炎及胰腺癌中表達分別為48.6％,80％,92.2％,統(tǒng)計學顯示 SIRT1在慢性胰腺炎及胰腺癌中表達明顯高于正常胰腺組織(P<0.001)。在 HIC1甲基化陽性的胰腺組織樣本中,HIC1蛋白表達陽性率明顯低于 HIC1甲基化陰性組(P<0.001)。HIC1蛋白表達與患者的年齡、腫瘤 TNM分期相關(guān)(P<0.01),與腫瘤直徑、腫瘤組織分化程度無關(guān)(P>0.05)。實

7、時熒光定量PCR證實胰腺組織樣本中HIC1和SIRT1 mRNA表達水平和蛋白表達水平一致。胰腺癌細胞系 PANC-1、BXPC-3以及ASPC-1中均存在 HIC1啟動子甲基化和HIC1蛋白表達缺失。5-aza-dC干預(yù)可逆轉(zhuǎn)胰腺癌細胞中HIC1的甲基化狀態(tài),恢復(fù) HIC1蛋白表達的同時下調(diào) SIRT1的蛋白表達。MTT檢測發(fā)現(xiàn)5-aza-dC處理后細胞增殖明顯減緩。流式細胞學檢測發(fā)現(xiàn)5-aza-dC處理胰腺癌細胞系后三株細胞均出現(xiàn)明

8、顯的G1期阻滯,并可以誘導(dǎo) PANC-1細胞凋亡。β半乳糖苷酶染色檢測發(fā)現(xiàn)5-aza-dC干預(yù)后在3株胰腺癌細胞中均出現(xiàn)衰老比例增加。真核表達質(zhì)粒pCDNA3FlagHIC1轉(zhuǎn)染PANC-1細胞后,通過 G418篩選獲得 HIC1穩(wěn)定表達細胞。western blot檢測發(fā)現(xiàn)在該細胞中SIRT1表達明顯下降。MTT檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染穩(wěn)轉(zhuǎn) HIC1的PANC-1細胞相對野生型PANC-1細胞增殖速度明顯減慢,β半乳糖苷酶染色檢測發(fā)現(xiàn)衰老細胞比例

9、明顯增加(16.3±3.1％ vs56.6±5.5％)。流式細胞學檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細胞出現(xiàn) G1期停滯(55.3±2.5％ vs70.6±2.3％),凋亡比例增加(2.7±0.5％ vs13.4±1.1％)。在穩(wěn)轉(zhuǎn) HIC1的PANC-1細胞中轉(zhuǎn)染 pCDNA3FlagSIRT1可以再次上調(diào) SIRT1的表達,促進細胞增殖、抑制細胞的衰老、緩解 G1期阻滯,但對細胞凋亡無明顯影響。5-aza-dC干預(yù)三株胰腺癌細胞可以誘導(dǎo) p21WAF1

10、/CIP1表達上調(diào),但對總 P53和乙?；?P53蛋白表達無明顯影響;穩(wěn)轉(zhuǎn) HIC1的PANC-1細胞相對于野生型 PANC-1細胞乙?；?P53比例增加,p21WAF1/CIP1表達上調(diào)。再次轉(zhuǎn)染 pCDNA3FlagSIRT1后可以部分逆轉(zhuǎn)其表達。
　　結(jié)論:
　　1.HIC1啟動子甲基化水平在慢性胰腺炎組織和胰腺癌組織中逐漸增加,與患者年齡、腫瘤 TNM分期密切相關(guān)。HIC1甲基化水平和HIC1蛋白表達呈負相關(guān)。HIC

11、1和SIRT1胰腺組織中呈排他性表達趨勢,說明胰腺癌組織中HIC1甲基化有可能通過沉默 HIC1蛋白表達導(dǎo)致 SIRT1表達上調(diào),為體外研究 HIC1/SIRT1通路奠定了基礎(chǔ)。
　　2.通過去甲基化試劑5-aza-dC可以逆轉(zhuǎn)胰腺癌細胞中HIC1甲基化,下調(diào) SIRT1的表達,并能顯著抑制細胞增殖,誘導(dǎo)細胞衰老和G1期阻滯。說明對 HIC1表觀遺傳學的調(diào)控可以發(fā)揮抑制胰腺癌生長的作用。
　　3.成功構(gòu)建 HIC1穩(wěn)轉(zhuǎn) PA

12、NC-1細胞系,靶向上調(diào) HIC1表達可以抑制SIRT1表達,抑制細胞增殖,誘導(dǎo)細胞衰老和G1期阻滯。再次上調(diào) SIRT1可部分逆轉(zhuǎn) HIC1上調(diào)所帶來的生物學效應(yīng)。證實在胰腺癌細胞中HIC1通過 SIRT1發(fā)揮生物學作用。
　　4.5-aza-dC逆轉(zhuǎn) HIC1甲基化和外源性基因調(diào)控 HIC1/SIRT1表達可以影響乙?；疨53的比例和p21WAF1/CIP1蛋白的表達,說明乙酰化 P53和P21是 HIC1/SIRT1信號通路