PAP1基因和PAP2基因的克隆及其相關(guān)生物信息學(xué)研究.pdf

1、目的：腫瘤抑制蛋白P53是一個通用轉(zhuǎn)錄因子，通過激活或抑制其下游基因的表達(dá)，在應(yīng)答諸如癌基因表達(dá)、缺氧以及DNA損傷等細(xì)胞脅迫信號方面起著關(guān)鍵作用。P53及其下游基因組成了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，了解該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)無論對于理解P53的生理功能、腫瘤臨床基因治療或是藥物發(fā)現(xiàn)等都具有十分重大的意義。而了解P53調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵是鑒定p53下游基因。本研究首先利用分子生物學(xué)的方法克隆新的p53下游基因，并對其功能進(jìn)行初步研究；其次利用生物信息學(xué)方法對整

2、個人類基因組DNA中存在的p53下游基因進(jìn)行預(yù)測分析；從而進(jìn)一步完善p53基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 方法：利用哺乳動物基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，Tet-On<'TM>基因表達(dá)系統(tǒng)，以人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251為實驗材料，建立p53基因可誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)p53基因細(xì)胞系，并構(gòu)建p53基因過度表達(dá)的cDNA文庫。通過差異顯示、測序、同源性比較及cDNA文庫篩選等方法克隆新的p53下游基因。對新克隆的p53下游基因利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測，通過凝

3、膠滯留實驗研究新克隆的p53下游基因調(diào)控序列與P53蛋白結(jié)合狀態(tài)，并利用Northern blot、原位雜交等分子生物學(xué)實驗技術(shù)研究克隆的基因在小鼠胚胎發(fā)育過程中表達(dá)規(guī)律。 結(jié)果：主要包括以下五個方面： 一、建立了p53基因可誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)p53基因細(xì)胞系，命名為U251-pTet-p53。該細(xì)胞系在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)下，外源性p53基因過度表達(dá)，在沒有強(qiáng)力霉素的培養(yǎng)基條件下，外源性p53基因幾乎不表達(dá)。差異顯示結(jié)果表明：外源性

4、p53基因過度表達(dá)，能引起細(xì)胞內(nèi)許多基因的差異表達(dá)，有的基因表達(dá)上調(diào)，有的基因表達(dá)下調(diào)。所有這些差異表達(dá)的基因都有可能是p53下游基因。對觀察到的有差異表達(dá)的11個EST進(jìn)行測序，其中2個代表未報道的新基因。 二、建立了p53基因過度表達(dá)時的cDNA文庫。并對第一部分差異顯示獲得的兩個新的EST，進(jìn)一步通過cDNA文庫篩選獲得全序列，分別命名為PAP1(p53 activated protein 1)(GenBank 收錄號：A

5、F497245)和 PAP2(p53 actirated protein 2)(GenBank 收錄號：AY093673)。 三、PAP1基因的結(jié)構(gòu)與功能： 1、PAP1基因的生物信息學(xué)分析表明： (1)、PAP1基因定位于人類染色體16p12-13，整個基因由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成； (2)、PAP1基因啟動子和前3個內(nèi)含子中含有許多P53蛋白結(jié)合位點； (3)、PAP1基因cDNA全長27

6、79 bp，開放閱讀框起始第282 nt，終止位點第1130nt，全長846bp。預(yù)測其編碼蛋白分子量為32.9KD，理論等電點pI為5.81，化學(xué)方程式為C<,1505>H<,2309>N<,385>O<,421>S<,11>。 (4)、PAP1蛋白的二級結(jié)構(gòu)：40％為α螺旋，17％為β折疊，43％為其它類型的二級結(jié)構(gòu)。PAP1蛋白為親水性蛋白，存在一個跨膜區(qū)，大約在42-79氨基酸片段，沒有信號肽。 (5)、PAP1

7、 基因?qū)倜庖咔虻鞍壮易?IGSF)成員，與黑猩猩、狗、小鼠、雞、牛等物種具有高度同源性，在進(jìn)化過程中十分保守。 2、分子生物學(xué)實驗結(jié)果表明： (1)、內(nèi)含子 2 中的P53 蛋白結(jié)合位點，GAGCTTGTCCcccGAtCAAGCCC，能與P53蛋白結(jié)合，說明PAP1基因是p53下游基因； (2)、PCNA 免疫組織化學(xué)和細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果表明：小鼠胚胎發(fā)育的第9-10天主要以細(xì)胞增殖為主的時期；胚胎第11-14

8、天是細(xì)胞增殖和凋亡的逐漸趨于平衡的階段；不同組織的發(fā)育進(jìn)程不同。 (3)、Northern blot結(jié)果表明PAP1基因(實際上是PAP1在小鼠中的同源基因IGSF6)在小鼠胚胎不同的發(fā)育時期表達(dá)有差異。 (4)、原位雜交顯示：PAP1基因(實際上是PAP1在小鼠中的同源基因IGSF6)在第11-14天中，肺、腎、腸及脊柱組織中特異性表達(dá)，說明PAP1基因參與了這些主要器官的發(fā)育過程，通過與發(fā)育過程的細(xì)胞增殖與凋亡趨勢比

9、較，該基因很可能與胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞凋亡有關(guān)。 四、PAP2基因的生物信息學(xué)分析表明： (1)、PAP2基因定位于人類17號染色體上； (2)、mRNA全長2007bp轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域起始位167bp處，啟動子序列在反鏈1998-1748處，開放閱讀范952bp-146lbp，全長 510bp； (3)、它編碼蛋白全長 169aa，分子量為19247.3，理論等電點為12.56，化學(xué)式為C<,818>H<,

10、1355>N<,317>O<,208>S<,9>。沒有發(fā)現(xiàn)信號肽和跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，屬于親水性，非分泌性蛋白； (4)、PAP2蛋白亞細(xì)胞定位在核內(nèi)； (5)、PAP2 蛋白二級結(jié)構(gòu)：α螺旋20.71％，β折疊4.14％，其他75.15％。 五、本研究共收集已報道的49個p53下游基因及72條P53蛋白結(jié)合序列。 1、統(tǒng)計分析結(jié)果： (1)、基本上與El-Deiry等定義的一致性保守序列特征吻合，但在

11、十聚體的絕大多數(shù)位點都存在錯配，錯配率在10-20％； (2)、對于整個十聚體，錯配數(shù)為3的基因占34.4％，錯配數(shù)為4的基因占12.7％，錯配數(shù)為5的基因占6.35％。因此，我們認(rèn)為用一致性序列模型預(yù)測p53下游基因時，整個十聚體的允許的錯配數(shù)為4比較恰當(dāng)； (3)、在一致性序列中，插入的堿基數(shù)與錯配數(shù)呈正相關(guān)。 2、建立logistic回歸模結(jié)果如下： (1)、采用兩個PWM矩陣來分別對前后十聚體建模

12、，并采用交叉驗證法確定已報道的結(jié)合序列中的模體，將確定位置的模體特征信息作為logistic回歸分析的對象，通過SPSS提供的logistic回歸分析模型對特征逐步選取，最終確定以前后十聚體的PWM得分作為特征信息建立了logistic回歸模型，閾值設(shè)為0.1076，其中hpwmsc，tpwmsc分別表示motif的前后十聚體中PWM模型得分。 (2)、用已報道的P53結(jié)合序列作為正數(shù)據(jù)集，隨機(jī)挑選的CDS序列作為負(fù)數(shù)據(jù)集，并對

13、正數(shù)據(jù)集和負(fù)數(shù)據(jù)集進(jìn)行刀切法測試驗證了方法的有效性，平均正確率達(dá)到了93.91％。 (3)、利用我們總結(jié)的保守性一致性序列模型、修正后一致性序列模型及建立的logistic回歸模型，采用Perl語言編寫程序，對人類基因組數(shù)據(jù)中P53結(jié)合位點進(jìn)行分析比較，表明logistic回歸模型的識別性能更加優(yōu)異，而且該模型還具有良好的可擴(kuò)展性，能夠方便地容納新特征，使識別性能不斷提高。 3、對人類基因組DNA進(jìn)行p53下游基因預(yù)測分析結(jié)果：

14、 (1)、利用保守性一致性序列預(yù)測到p53下游基因1693個； (2)、利用允許錯配數(shù)為4的一致性序列(串模型)預(yù)測到p53下游基因22107個； (3)、利用logistic回歸模型預(yù)測到p53下游基因15182個； 4、基于GO對p53下游基因進(jìn)行功能分類結(jié)果： (1)、細(xì)胞組分：p53下游基因主要的功能集中在細(xì)胞、細(xì)胞器及蛋白復(fù)合物等幾個區(qū)域。 (2)、分子功能：p53下游基因功能主

15、要有結(jié)合、催化活性、酶調(diào)節(jié)活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、結(jié)構(gòu)分子行為、轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)活性、運(yùn)輸行為和未知分子功能等幾個方面。而在轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)活性、運(yùn)輸行為和未知分子功能等功能區(qū)域中有非常多p53下游基因還沒有被發(fā)現(xiàn)。 (3)、生物過程：p53下游基因參與的生物過程主要包括細(xì)過程胞內(nèi)一生理過程、生物學(xué)過程調(diào)節(jié)、刺激應(yīng)答等，在發(fā)育、未知的生物學(xué)過程等有非常多的p53下游基因還沒有被發(fā)現(xiàn)。 結(jié)論：主要包括如下： (1)建立了p53基因可誘

16、導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)p53基因細(xì)胞系，命名為U251-pTet-p53。該細(xì)胞系中外源性p53基因可以被強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)過度表達(dá)。 (2)構(gòu)建了p53基因過度表達(dá)時的cDNA文庫。 (3)PAP1基因是新克隆的p53下游基因，定位于人類染色體16p12-13，由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成。PAP1基因編碼的蛋白屬免疫球蛋白超家族(IGSF)成員，在進(jìn)化過程中十分保守。PAP1基因在小鼠胚胎發(fā)育過程中，肺、腎、腸及脊柱組織中有特異性表達(dá)

17、，很可能與這些器官發(fā)育過程中的細(xì)胞凋亡有關(guān)。 (4)PAP2基因是新克隆的p53下游基因，定位于人類17號染色體上，其編碼的蛋白在進(jìn)化過程中十分保守； (5)對已報道的p53下游基因分析表明，用一致性序列模型預(yù)測p53下游基因時，整個十聚體允許的錯配數(shù)為4比較恰當(dāng)； (6)建立了預(yù)測p53下游基因的logistic回歸模型，閾值設(shè)為0.1076，其中hpwmsc，tpwmsc分別表示motif(decamers)