P53下游候選基因PAP1的鑒定和生物信息學(xué)分析.pdf

1、p53基因是與人類腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因。前人研究表明，p53基因行使其生物學(xué)效應(yīng)主要是通過P53蛋白與特異基因組序列結(jié)合，激活下游基因轉(zhuǎn)錄、作用來實(shí)現(xiàn)的。因此，鑒定p53下游基因是了解p53基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵。 本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中建立攜帶野生型p53轉(zhuǎn)基因的U251-pTet-p53細(xì)胞系，在四環(huán)素應(yīng)答元件的控制下，誘導(dǎo)p53基因表達(dá)。通過差異顯示技術(shù)，克隆到一個(gè)新的P53下游基因候選基因——PAP1基因。 本文構(gòu)

2、建了pET28b-p53重組表達(dá)質(zhì)粒，將pET28b-p53轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)P53蛋白。用地高辛標(biāo)記PAP1基因作為探針，與P53蛋白做凝膠滯留實(shí)驗(yàn)，鑒定P53蛋白下游候選基因PAP1。然后綜合運(yùn)用生物信息學(xué)方法對PAP1基因進(jìn)行了基因結(jié)構(gòu)分析和功能分析。 研究結(jié)果顯示：(1)該基因序列能與野生型P53蛋白結(jié)合，與突變型P53蛋白幾乎不結(jié)合。因此PAP1基因是P53蛋白的下游基因，受P53蛋白調(diào)

3、控。(2)PAP1基因定位于人類染色體16p12-13上，PAP1蛋白分子量為32.9KD，理論等電點(diǎn)pI為5.81，化學(xué)方程式為C1505H2309N385O421S11，半衰期為30小時(shí)左右，不穩(wěn)定指數(shù)：42.58，脂肪族指數(shù)Aliphaticindex：95.64，總平均疏水性：-0.162。PAP1蛋白為親水性蛋白，存在一個(gè)跨膜區(qū)，大約在42-79氨基酸片段，沒有信號肽。(3)PAP1基因?qū)儆贒REV1轉(zhuǎn)甲基酶基因家族。PAP1

4、mRNA對GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性搜索-BLASTN，與DREV1基因的相似性很高，將它們進(jìn)一步做雙序列比對發(fā)現(xiàn)它們的相似性在80.8﹪，除了在開頭和結(jié)尾的相似性很差之外，其它部分相似性較高。PAP1與DREV1，CD4，TCRα、β、γ多序列比對時(shí)，存在幾個(gè)保守的位點(diǎn)。PAP1與各個(gè)物種的同源基因的多序列比對，它們的保守性很高。(4)PAP1蛋白的二級結(jié)構(gòu)為混合型，40﹪為α螺旋，17﹪為β折疊，43﹪為其它類型的二級結(jié)構(gòu)；含有