擬穴青蟹耐寒相關基因ANT2、CCTα和SCD的分子克隆與脅迫應答.pdf

1、腺苷酸轉移酶(adenine nucleotide translocase，ANT)，屬于線粒體轉運蛋白超家族，是線粒體中最豐富的蛋白質之一，主要作用是介導ADP/ATP在細胞質和線粒體基質之間的運輸。伴侶素包含T型復合體(the chaperonin containingtailless complex polypeptideα，CCTα)是幾乎存在所有生物體中的一類分子伴侶，負責細胞內蛋白的組裝和折疊。內質網內的硬脂酰去飽和酶(st

2、earoyl-CoAdesaturase，SCD)，是一類含鐵離子的限速酶，主要催化硬脂酰輔酶A(C18∶0)和軟脂酰輔酶A(C16∶0)向油酸(C18∶1)和棕櫚油酸(C16∶1)等單不飽和脂肪酸的轉化，并在C9-C10之間引入雙鍵。為探討這3個基因在擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)低溫脅迫中的作用，本文采用RT-PCR、RACE等技術，首次從擬穴青蟹中獲得了ANT2、CCTα、SCD的cDNA全長序列，并運用實時定量

3、PCR技術檢測了三個基因，在不同組織和不同溫度以及不同溫度鹽度聯(lián)合條件下的表達譜。主要結果如下:
　　1) ANT2的研究結果:
　　擬穴青蟹ANT2序列全長1348 bp，開放閱讀框(ORF)為930 bp，編碼309個氨基酸殘基。同源分析顯示，該蛋白具有3個保守的線粒體跨膜功能結構域;實時定量PCR結果表明，ANT2基因在成熟擬穴青蟹雌體的心臟組織中表達最高，其次分別是鰓和肌肉組織。在10℃、15℃、20℃和25℃等4個

4、溫度條件下，第一期仔蟹(C1)的ANT2基因在10℃和15℃表達量顯著低于20℃和25℃，且10℃的表達量顯著低于15℃;另外，隨著溫度降低，幼蟹ANT2基因總體上趨低表達。低溫下C1仔蟹和幼蟹ANT2基因表達變化，提示該基因與能量代謝功能相關，可能參與擬穴青蟹低溫脅迫應答;相同低溫(10℃和15℃)下，幼蟹肌肉、肝胰腺、鰓三種組織中ANT2基因在鹽度10的表達量通常高于鹽度35，說明低溫低鹽條件下青蟹需要進一步提高體內代謝來應對環(huán)境脅

5、迫。
　　2) CCTα的研究結果:
　　擬穴青蟹CCTα序列全長1972 bp，開放閱讀框(ORF)為1668 bp，編碼555個氨基酸殘基。同源分析顯示，該蛋白具有4個保守的功能結構域;實時定量 PCR結果表明CCTα基因在擬穴青蟹肌肉組織中表達量最高，其次是鰓和肝胰腺;幼蟹在4個溫度下，肌肉、肝胰腺、鰓中CCTα基因表達量在10℃均顯著高于15℃、20℃、25℃;15℃下的表達量顯著高于20℃和25℃。這些數(shù)據(jù)表明該基

6、因可能參與青蟹細胞中蛋白修復和細胞骨架構建的過程，來應對低溫脅迫;在低溫和鹽度聯(lián)合的實驗中，相同低溫(10℃和15℃)下，三種組織中CCTα基因在鹽度35的表達量通常低于鹽度10，說明低溫下高鹽環(huán)境對青蟹損傷較小。
　　3) SCD研究結果:
　　擬穴青蟹SCD序列全長1356 bp，開放閱讀框(ORF)為1041 bp，編碼347個氨基酸殘基。同源分析顯示，該蛋白具有4個跨膜區(qū)域和三個組氨酸功能區(qū)域;實時定量PCR結果表明

7、SCD基因在擬穴青蟹所有檢測組織中均有表達，且在肝胰腺組織中表達量最高;在4個溫度下，C1期仔蟹SCD基因表達量在15℃均顯著高于10℃、20℃、25℃;20℃和25℃二者之間差異不顯著。SCD可能在增加不飽和脂肪酸進而增加細胞膜流動性中參與了擬穴青蟹低溫脅迫應答。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)擬穴青蟹存在ANT2、CCTα、SCD三個基因。這三個基因在低溫下的表達模式和三個基因各自發(fā)揮的功能顯示它們可能與青蟹的寒冷適應有關。研究結果