擬穴青蟹硫氧還蛋白系統(tǒng)及抗氧化相關(guān)基因的研究分析.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)是我國(guó)沿海最為常見(jiàn)的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種,其養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量都很大,是我國(guó)重要的三大經(jīng)濟(jì)蟹類之一,具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,因而具有很高的研究?jī)r(jià)值。
  本文通過(guò)構(gòu)建文庫(kù)和RACE克隆等方法獲得了擬穴青蟹硫氧還蛋白-1基因cDNA序列,并運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析其在不同組織和副溶血弧菌感染條件下的表達(dá)情況;此外,對(duì)硫氧還蛋白還原酶在不同組織和細(xì)菌感染條件下的活性變化進(jìn)行了

2、分析;最后,運(yùn)用GeXP多重基因表達(dá)技術(shù)對(duì)擬穴青蟹抗氧化系統(tǒng)中的部分基因進(jìn)行了初步探究。主要研究結(jié)果如下:
  1.硫氧還蛋白(Thioredoxin, Trx)屬于氧化還原蛋白家族。本文運(yùn)用SMART技術(shù)獲得了擬穴青蟹Trx1基因的cDNA全長(zhǎng),系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示它與其他物種Trx基因具有較高的同源性,綜合分析后確定命名為擬穴青蟹硫氧還蛋白-1基因(SpTrx1)。SpTrx1的cDNA全長(zhǎng)672 bp,包括318 bp的開(kāi)放閱讀

3、框(ORF),編碼105個(gè)氨基酸,分子量約為12.05 kDa,等電點(diǎn)約為4.85。運(yùn)用熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR)技術(shù)檢測(cè)SpTrx1在擬穴青蟹不同組織(肝胰腺、血液、心臟、肌肉、精巢、鰓)中的表達(dá)差異,結(jié)果顯示SpTrx1在6個(gè)組織中均有表達(dá),其中鰓和精巢中最高,血液中最低。SpTrx1組織表達(dá)的普遍性說(shuō)明它參與了擬穴青蟹的基礎(chǔ)代謝。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus

4、)感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:血液中的SpTrx1在感染后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的表達(dá)量變化差異顯著(P<0.05),在前12 h之間變化不明顯,至12 h時(shí)突然下降,18 h小時(shí)開(kāi)始逐漸上升,在48 h顯著升高,72 h達(dá)到最高值,隨后緩緩下降,96 h恢復(fù)正常水平。表明SpTrx1在血液中的作用緩慢而持續(xù),推測(cè)該基因可能與機(jī)體防御和抵抗外來(lái)入侵病源菌密切相關(guān),參與擬穴青蟹的抗病過(guò)程。
  2.硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin Reduct

5、ase,TrxR)是一種二聚體硒酶,屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族,催化依賴硫氧還蛋白NADPH的還原反應(yīng)。本文根據(jù)DTNB還原法原理,運(yùn)用比色方法檢測(cè)擬穴青蟹不同組織(肝胰腺、血液、心臟、肌肉、鰓)以及弧菌感染后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)不同組織(血液、鰓、肝胰腺、心臟)中TrxR的活性變化情況。結(jié)果顯示,TrxR的活性在鰓和心臟中較高,其次是血液,肝胰腺和肌肉?;【碳?shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在副溶血弧菌刺激后,TrxR的活性在血液、鰓、肝胰腺和心

6、臟組織中具有大致相同的變化趨勢(shì):在2-6h活性較低,8 h-24 h活性最高,48h之后開(kāi)始緩慢降低,直至72 h恢復(fù)正常水平。表明TrxR可能參與擬穴青蟹機(jī)體的抗氧化反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。
  3.抗氧化系統(tǒng)可以清除體內(nèi)過(guò)多的氧自由基、保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷,維持機(jī)體內(nèi)氧環(huán)境平衡,抵抗外界環(huán)境影響。本文運(yùn)用GeXP多重表達(dá)技術(shù)研究擬穴青蟹中與抗氧化相關(guān)的8個(gè)基因在不同組織以及弧菌感染后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)血液中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,Cu/ZnS

7、OD和CAT在肝胰腺和血液中表達(dá)量較高,Trx1在鰓和血液中表達(dá)量較高,MnSOD在血液、肝胰腺、心臟和精巢中的表達(dá)量較高,PRX在血液和鰓中表達(dá)量比較高,Trx2和GSTs在鰓和肝胰腺中表達(dá)量高,GPX在心臟和鰓中表達(dá)量最高。它們?cè)诩∪夂途仓斜磉_(dá)均很低。該結(jié)果顯示血液、肝胰腺和鰓可能是擬穴青蟹免疫反應(yīng)的主要組織和器官,可能在抗氧化和免疫防御中具有重要作用。在弧菌感染后表達(dá)量差異顯著(P<0.05),這8個(gè)基因的變化趨勢(shì)幾乎一致,在感

8、染的前4h變化不明顯,4h的表達(dá)量基本很低,6h突然上升,處于最高水平,8 h小時(shí)迅速恢復(fù)平穩(wěn),在12 h顯著升高,24h-96h下降直到恢復(fù)正常。GSTs、PRX,Trx1在6 h表達(dá)量均較高;Cu/ZnSOD和Trx2在6 h和12 h表達(dá)量顯著升高;GPX和MnSOD在8 h表達(dá)量較高,CAT在6 h和12 h之間表達(dá)量顯著升高,這8個(gè)基因表達(dá)量的最高峰出現(xiàn)在不同的時(shí)間節(jié)點(diǎn),但又主要集中在6 h和12 h之間,表明它們?cè)跀M穴青蟹抗

9、氧化系統(tǒng)整個(gè)通路中是相互作用但又相對(duì)獨(dú)立。本章研究的與抗氧化相關(guān)的8個(gè)基因普遍存在于擬穴青蟹的不同組織中,以及它們?cè)诨【腥竞蟮淖兓?guī)律暗示了它們可能在擬穴青蟹抗氧化和免疫防御中起著重要的作用。
  綜上所述,本研究獲得了擬穴青蟹SpTrx1基因cDNA全長(zhǎng),并且發(fā)現(xiàn)SpTrx1的mRNA表達(dá)變化與TrxR的活性變化在不同組織以及副溶血弧菌刺激后都表現(xiàn)出高度一致性,表明SpTrx1和TrxR在擬穴青蟹硫氧還蛋白系統(tǒng)中協(xié)同作用,相輔

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