慢病毒介導(dǎo)對(duì)TGF-β失敏感的腫瘤特異性CTL在前列腺癌免疫治療中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：目前我國(guó)診斷的前列腺癌患者仍以晚期患者為主，而對(duì)于晚期患者，治療方式仍以內(nèi)分泌治療為主。在任何內(nèi)分泌治療過(guò)程中，前列腺癌都不可避免地發(fā)展為激素難治性前列腺癌。而激素難治性前列腺癌的治療是目前前列腺癌治療中的重點(diǎn)與難點(diǎn)。雖然各種治療方法層出不窮，從化療到放療，從生物治療到同位素治療，但真正能延長(zhǎng)生存的治療方法并不多。腫瘤免疫學(xué)認(rèn)為：腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤逃逸密切相關(guān)，而在腫瘤逃逸的因素中，腫瘤細(xì)胞自身分泌的免疫抑制因子具有重要作用。其

2、中TGF-β是腫瘤細(xì)胞分泌的已知的最強(qiáng)的免疫抑制因子。我們通過(guò)用攜帶顯性負(fù)相的TGF-βII型受體基因的慢病毒載體感染人CTL，使其對(duì)TGF-β不敏感，然后研究對(duì)TGF-β失敏感的腫瘤特異性CTL在前列腺癌治療中的作用和意義，為晚期前列腺癌的治療探索一條新的治療途徑。 方法：分三個(gè)步驟進(jìn)行：首先，在已有的pMIG-TβRIIDN(MSCV-RIIDN-IRES-GFP)和pAdTrack-CMV-TK質(zhì)粒的基礎(chǔ)上制備感染效率高的

3、慢病毒載體，此載體攜帶顯性負(fù)相的FGF-βII型受體(dominantnegativeTGF-betatypeIIreceptor)和HSV-tk(herpessimplexvirusthymidinekinase)融合基因，HSV-tk基因主要用于去除多余的淋巴細(xì)胞。其次，前列腺根治性切除術(shù)時(shí)采集新鮮前列腺癌組織標(biāo)本，分為兩部分，一部分儲(chǔ)存于組織庫(kù)，另一部分立即剪成1～2mm的小塊，用基底膜基質(zhì)(MatrigelBasementMem

4、braneMatrix)進(jìn)行包埋，1天后種植于4周齡雄性裸鼠前側(cè)軀干皮下。待皮下包塊長(zhǎng)到1.5cm大小時(shí)，取出腫瘤組織塊，再進(jìn)行裸鼠傳代。當(dāng)?shù)谌傲邢侔┊惙N移植模型的皮下組織塊長(zhǎng)到1.5cm時(shí)采集與組織來(lái)源同一患者的外周血20ml，然后進(jìn)行單核細(xì)胞體外分離，當(dāng)天將DC與CTL分開培養(yǎng)。5天后用腫瘤抗原粗提物刺激體外培養(yǎng)的DC細(xì)胞，48小時(shí)后將DC和CTL細(xì)胞混合培養(yǎng)，使CTL具有腫瘤特異性。第三，用慢病毒將顯性負(fù)的TβRIIDNgly

5、tk基因?qū)氲侥[瘤特異性的CTL細(xì)胞，獲得對(duì)TGF-β不敏感的同源的腫瘤特異性CTL細(xì)胞。第四，以表達(dá)TRANSglytk蛋白的CTL作對(duì)照，驗(yàn)證所制備的對(duì)TGF-β不敏感的腫瘤特異性的CTL細(xì)胞對(duì)腫瘤異種移植裸鼠模型所負(fù)載的前列腺癌的治療作用。 結(jié)果： 1、運(yùn)用重組PCR技術(shù)合成了TβRIIDNglytk及TRANSglytk基因，將此基因用Invitrogen公司的TOPO技術(shù)連接到pLenti6/V5-D-TOPO

6、()載體，構(gòu)建成功了慢病毒表達(dá)載體，并經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證；并制備了含有TβSRIIDNglytk及TRANSglytk基因的慢病毒液，病毒滴度分別達(dá)到了5.85×106和6.2×106。 2、前列腺癌腫瘤蛋白粗提物能有效刺激DC，進(jìn)而使CTL細(xì)胞具有腫瘤抗原特異性；腫瘤特異性的CTL顯示了與非腫瘤特異性CTL不同的特點(diǎn)；攜帶TβRIIDNglytk或TRANSglytk基因的慢病毒可以有效轉(zhuǎn)染腫瘤特異性CTL；經(jīng)Westernblot

7、鑒定，表達(dá)TβRIIDNglytk蛋白的CTL對(duì)TGF-β反應(yīng)不敏感，而表達(dá)TRANSglytk蛋白的CTL卻在TGF-β刺激下出現(xiàn)較強(qiáng)的TGF-β下游蛋白P-Smad2/3的表達(dá)；表達(dá)TβRIIDNglytk或TRANSglytk蛋白的CTL能被GCV殺滅，提示轉(zhuǎn)入的HSV-tk基因是有效的，運(yùn)用此系統(tǒng)可以作為殺滅多余CTL的工具。 3、用裸鼠成功建立前列腺癌異種移植模型，用體外過(guò)繼培養(yǎng)得到的對(duì)TGF-β不敏感的腫瘤特異性CT