乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移檢測(cè)及特異性免疫治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：乳腺癌已成為女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，并呈逐年升高趨勢(shì)，雖然采取以手術(shù)為主的綜合治療措施，但其遠(yuǎn)期生存率并沒有獲得明顯提高，影響預(yù)后的主要因素是發(fā)生了遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移。據(jù)臨床資料統(tǒng)計(jì)顯示，約有25～30％腋淋巴結(jié)陰性的乳腺癌患者，于術(shù)后5年內(nèi)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致治療失敗，如果能在早期檢測(cè)到微小轉(zhuǎn)移灶，則對(duì)疾病的分期、治療及改善預(yù)后具有重要意義。骨髓是乳腺癌最易發(fā)生轉(zhuǎn)移的部位，骨髓微轉(zhuǎn)移(bone marrow micrometasta

2、sis，BMM)的檢測(cè)較腋窩淋巴結(jié)和外周血更能反映腫瘤細(xì)胞的全身播散情況，不僅能動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移、觀察療效，并可成為預(yù)測(cè)乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立因素。因此，對(duì)于遠(yuǎn)處微小轉(zhuǎn)移灶的早期檢測(cè)及治療成為提高乳腺癌患者遠(yuǎn)期生存率的主要途徑之一。 造成乳腺癌患者治療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因是機(jī)體免疫力低下及腫瘤的免疫逃逸機(jī)制。因此，免疫治療正逐漸成為腫瘤綜合治療的研究熱點(diǎn)，有望成為腫瘤治療的又一主要手段。免疫治療中常用的活性細(xì)胞有：淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞

3、(LAK)、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)和特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)。有報(bào)道提出，利用樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)的高抗原遞呈活性，將乳腺癌細(xì)胞抗原肽負(fù)載DC，從而激活機(jī)體免疫反應(yīng)，可促進(jìn)抗瘤效應(yīng)和特異性。樹突狀細(xì)胞作為唯一的專職抗原遞呈細(xì)胞(antigen processing cell，APC)，處于免疫反應(yīng)的中心地位。非成熟的DC捕獲抗原后被激活成為成熟的DC，其細(xì)胞表面表

4、達(dá)MHC Ⅰ類和Ⅱ類分子、共刺激分子B<,7>-1(CD80)和B<,7>-2(CD86)、黏附分子CD54(ICAM-1)和CD50(ICAM-3)等，并將抗原肽遞呈給CD4<'+>和CD8<'+>T細(xì)胞，誘導(dǎo)其成為特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，分泌細(xì)胞因子(如IL-12等、)，產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答而發(fā)揮抗腫瘤作用。 我們采用免疫磁珠(IMB)富集聯(lián)合掃描電鏡(SEM)及激光共聚焦顯微鏡(LSM)，檢測(cè)了乳腺癌患者骨髓微轉(zhuǎn)移

5、(BMM)；從乳腺癌患者腋窩區(qū)域引流淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞中，誘導(dǎo)培養(yǎng)DC和腫瘤抗原特異性CTL，通過體外和乳腺癌荷瘤裸鼠體內(nèi)殺傷實(shí)驗(yàn)，以期尋找一種治療乳腺癌微轉(zhuǎn)移的新途徑。 方法： 第一部分IMB聯(lián)合SEM、LSM檢測(cè)乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移 選取2006年3月至10月我院收治的乳腺癌患者45例，健康志愿者04例(均簽署了骨髓穿刺知情同意書)。研究對(duì)象均為女性，年齡30～67歲，平均49.8歲。術(shù)前在局部浸潤(rùn)麻醉下，行髂前上

6、棘骨髓穿刺，抽取骨髓10～15ml，應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分離、收集有核細(xì)胞，IMB富集陽(yáng)性對(duì)照、正常人對(duì)照、乳腺癌患者骨髓中轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞，將富集后細(xì)胞分成兩等份，一份在SEM下采集腫瘤細(xì)胞圖像，另一份用anti-CK-FITC標(biāo)記細(xì)胞，在LSM下檢測(cè)CK<'+>細(xì)胞。將乳腺癌細(xì)胞株MDA-231制作成電鏡標(biāo)本，SEM下采集標(biāo)準(zhǔn)乳腺癌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)圖象。 第二部分乳腺癌腋下淋巴結(jié)來源的DCs對(duì)自體CTLs體外特異性殺傷活性的影響

7、 術(shù)中嚴(yán)格無菌摘取乳腺癌引流淋巴結(jié)1～2枚，用機(jī)械法獲取淋巴細(xì)胞懸液，并用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，以含有10％胎牛血清的RPMIl640培養(yǎng)基重懸、培養(yǎng)2h，貼壁細(xì)胞以rhGM-CSF(1000U/ml)，rhIL-4(200U/ml)和TNF-α(200U/ml)聯(lián)合培養(yǎng)誘導(dǎo)DCs；非貼壁細(xì)胞，加入rhIL-2(200U/ml、)培養(yǎng)為TDLNCs。用酶消化法將乳腺癌組織制備自體乳腺癌單細(xì)胞懸液，通過凍融法制備腫瘤抗原，負(fù)

8、載DCs，將后者與TDLNCs共培養(yǎng)，以誘導(dǎo)腫瘤特異性CTLs。分別培養(yǎng)至第1天和第7天收獲DCs，加入PE-CD1a、PE-CD83、FITC-CD86單克隆抗體，用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞表型；于第7天和第10天收獲DC-TDLNCs，分別加入FITC-CD3單克隆抗體，F(xiàn)ITC-CD4/PE-CD8二聯(lián)抗體，檢測(cè)其細(xì)胞表型。用非放射性細(xì)胞毒分析試劑盒，測(cè)定不同方法誘導(dǎo)的CTLs細(xì)胞對(duì)自體乳腺癌細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的體外殺傷活性，分析

9、經(jīng)誘導(dǎo)的DCs功能和CTLs殺傷特異性。 第三部分自體腫瘤特異性CTLs對(duì)裸鼠乳腺癌模型抑瘤作用的研究 手術(shù)時(shí)分別無菌切取2例乳腺癌患者癌組織，剪成約1mmm<'3>大小組織塊。將32只3～4周齡BALB/c裸鼠隨機(jī)分成4組，每組8只，癌組織分別種植于裸鼠胸墊部皮下，建立裸鼠乳腺癌模型，移植瘤生長(zhǎng)2周后，每5天注射一次不同的免疫效應(yīng)細(xì)胞。(1)腫瘤特異性CTL組：每只裸鼠局部注射腫瘤特異性CTLs 0.2ml(5×10<

10、'6>/ml)；(2)非特異性CTL組：每只裸鼠局部注射未經(jīng)自體腫瘤凍融抗原激活的非特異性CTLs 0.2ml(5×10<'6>/ml)：(3)異體CTL組(種植另一患者癌組織)：每只裸鼠局部注射非自體腫瘤特異性CTLs 0.2ml(5×10<'6>/ml)；(4)空白對(duì)照組：每只裸鼠移植瘤模型局部注射生理鹽水0.2ml。每5天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑(a)、短徑(b)，按體積(V)=πab<'2>/6計(jì)算腫瘤體積，并計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率，

11、30天后處死裸鼠取出瘤塊。將腫瘤組織放入福爾馬林溶液中固定、脫水、石蠟包埋、切片。經(jīng)常規(guī)HE染色，鏡下觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)；免疫組化染色，觀察T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)情況。 結(jié)論： 1 IMB聯(lián)合SEM、LSM檢測(cè)原發(fā)性乳腺癌BMM，陽(yáng)性檢出率為35.6％。 2 乳腺癌BMM與原發(fā)腫瘤大小及臨床病理TNM分期有關(guān)，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力隨著原發(fā)腫瘤增大而增強(qiáng)，臨床分期越晚，出現(xiàn)骨髓轉(zhuǎn)移幾率越高。但腫塊小、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Ⅰ期

12、乳腺癌患者，亦存在約20％的BMM，提示乳腺癌是一種全身性疾病，轉(zhuǎn)移及播散很早即可發(fā)生。 3 雖然乳腺癌BMM與腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否無明顯相關(guān)性，但進(jìn)一步分層研究發(fā)現(xiàn)，隨著腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的增加BMM陽(yáng)性率增高，說明血行播散與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌轉(zhuǎn)移的兩條相對(duì)獨(dú)立的途徑，當(dāng)腋窩淋巴結(jié)出現(xiàn)較多轉(zhuǎn)移時(shí)，癌細(xì)胞可能通過淋巴導(dǎo)管再次入血從而增加了轉(zhuǎn)移機(jī)會(huì)。 4 乳腺癌BMM陽(yáng)性率隨組織學(xué)分級(jí)增加而升高，說明分化程度低的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)

13、的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力，對(duì)這部分病人應(yīng)加強(qiáng)化療等綜合性治療，密切關(guān)注全身轉(zhuǎn)移情況。 5 乳腺癌BMM陽(yáng)性率隨ER、PR蛋白表達(dá)增強(qiáng)而降低，說明分化愈差的腫瘤細(xì)胞，ER、PR丟失愈多，可能具有更強(qiáng)的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力。 6 本研究未發(fā)現(xiàn)乳腺癌BMM與患者的年齡、月經(jīng)狀況、病理類型及腫瘤組織中C-erbB-2、VEGF的表達(dá)有關(guān)。 7 乳腺癌患者腋下引流淋巴結(jié)來源的單個(gè)核細(xì)胞，在rhGM-CSF、rhIL.4刺激活

14、化和自體乳腺癌細(xì)胞凍融抗原及TNF-α作用下，可以誘導(dǎo)培養(yǎng)出具有典型細(xì)胞學(xué)形態(tài)特征和高表達(dá)DC特異性表面標(biāo)志物的成熟DCs，并具有較強(qiáng)的抗原提呈功能，可以促進(jìn)TDLNCs增殖、分化為腫瘤抗原特異性CTLs。 8 腫瘤抗原特異性CTLs對(duì)自體乳腺癌細(xì)胞有較高的體外殺傷效應(yīng)，而對(duì)異體乳腺癌細(xì)胞不具有特異性殺傷效應(yīng)。未經(jīng)自體乳腺癌細(xì)胞凍融抗原刺激誘導(dǎo)的DCs雖也可以使TDLNCs增殖、分化為CTs,但此CTLs不具有針對(duì)自體乳腺癌細(xì)胞