抗前列腺癌雙特異性抗體的構(gòu)建、表達(dá)、純化及其活性鑒定的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　1.構(gòu)建雙特異性雙鏈抗體BsDb(抗-PSMA×抗-FITC)的基因序列及質(zhì)粒載體pET-28(a)-BsDb,將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌中構(gòu)成BsDb的原核表達(dá)體系,以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并純化。
　　2.培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞系,檢測(cè)PSMA表達(dá)情況及鑒定雙特異性抗體BsDb的活性。
　　方法:
　　1.通過(guò)對(duì)本課題組先期測(cè)得的抗-PSMA單鏈抗體(ScFv-P)與抗-FITC單鏈抗體(ScFv-F)基因序列的分析

2、,獲得兩條ScFv各自的重鏈和輕鏈序列。通過(guò)VectorNTI9軟件將ScFv-P的重鏈(PVH)和輕鏈(PVL)與ScFv-F的輕重鏈(FVL和FVH)交叉連接,構(gòu)成PVH-Linker-FVL和PVL-Linker-FVH兩條雜合鏈,將其連接后以全基因合成的方法合成BsDb的基因片段。在其C端設(shè)計(jì)一個(gè)XbaⅠ酶切位點(diǎn),N端設(shè)計(jì)一個(gè)XhoⅠ酶切位點(diǎn)。將BsDb基因片段用XbaⅠ與XhoⅠ兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切并與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的p

3、ET-28(a)質(zhì)粒載體用T4連接酶連接成pET-28(a)-BsDb,將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21,以IPTG誘導(dǎo)其表達(dá),對(duì)表達(dá)產(chǎn)物用鎳親和層析柱進(jìn)行純化。
　　2.培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、PC-3和人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1,利用Westernblot檢測(cè)PSMA在體外培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)。
　　3.通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)、Westernblot等檢測(cè)BsDb與PSMA結(jié)合的特異性,通過(guò)ELISA檢測(cè)其與FITC結(jié)

4、合的特異性。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建BsDb基因序列,且將其成功導(dǎo)入pET-28(a)質(zhì)粒中形成pET-28(a)-BsDb,將該質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21實(shí)現(xiàn)原核表達(dá)。通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)劑IPTG濃度與溫度、搖床轉(zhuǎn)數(shù)、誘導(dǎo)時(shí)間等條件的選擇,最終摸索出實(shí)現(xiàn)BsDb可溶性表達(dá)的條件,即IPTG濃度選擇0.50‰,誘導(dǎo)溫度、搖床轉(zhuǎn)數(shù)和誘導(dǎo)時(shí)間分別為16℃,150rpm/min,12h。純化時(shí)目的蛋白通過(guò)鎳親和層析柱,其His標(biāo)簽與鎳

5、親和層析柱結(jié)合,但同時(shí)亦有雜蛋白與鎳親和層析柱非特異性結(jié)合,選擇不同濃度梯度的咪唑液洗滌,低濃度的咪唑可以將非特異性結(jié)合的蛋白洗脫,而高濃度的咪唑才能將與鎳親和層析柱特異結(jié)合的目的蛋白洗脫,這時(shí)收集則為純化的BsDb,最終的咪唑濃度梯度為平衡液選10mmol/L,然后分別用40、120、500mmol/L濃度咪唑洗脫,500mmol/L的咪唑洗脫的為目的蛋白。純化后的BsDb通過(guò)BCA蛋白定量法測(cè)得其濃度為181μg/ml。
　　

6、2.人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、PC-3以及人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1均為單層貼壁生長(zhǎng);Westernblot證實(shí)PSMA在LNCaP細(xì)胞中高表達(dá),而在其余兩種細(xì)胞系中不表達(dá)。
　　3.通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)和Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BsDb與PSMA有良好的結(jié)合特性,通過(guò)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其與FITC能特異性結(jié)合。
　　結(jié)論:
　　1.前列腺癌LNCaP細(xì)胞系高表達(dá)PSMA。
　　2.通過(guò)基因工程技術(shù)制備的雙特