靈芝三萜的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其對(duì)前列腺癌作用的研究.pdf

1、靈芝(Ganoderma lucidum)在我國(guó)已有上千年的藥用歷史,近年來(lái)靈芝三萜類化合物因被報(bào)道具有多用藥理活性而引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者們的廣泛關(guān)注,迄今為止已從靈芝中已分離得到了160余種三萜類化合物。但究竟該如何來(lái)開(kāi)發(fā)和應(yīng)用靈芝中的三萜類化合物?它們又究竟有哪些藥理活性?它們是通過(guò)何種途徑來(lái)發(fā)揮它們的藥理作用?這些問(wèn)題都成了近年來(lái)靈芝三萜的研究和應(yīng)用中亟待解決的問(wèn)題。因此,本研究選用當(dāng)今世界上最為先進(jìn)的萃取技術(shù)之一,即超臨界 CO2萃

2、取(SFE-CO2)技術(shù)萃取靈芝子實(shí)體中的三萜成分,再以抗前列腺癌細(xì)胞增殖的生物活性為活性跟蹤手段對(duì)靈芝中的三萜類化合物進(jìn)行系統(tǒng)的分離純化,然后再對(duì)分離得到的活性成分對(duì)抗前列腺癌的作用機(jī)制進(jìn)行研究。整個(gè)研究過(guò)程將提取和分離純化工藝的研究與生物活性的研究相結(jié)合,為合理地開(kāi)發(fā)和利用靈芝產(chǎn)品提供科學(xué)的數(shù)據(jù)。
　　在采用超臨界 CO2技術(shù)萃取靈芝子實(shí)體中的三萜成分的實(shí)驗(yàn)中,本論文通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定的最佳萃取條件為:子實(shí)體粒度10

3、目、夾帶劑95％乙醇、壓力35 Mpa、溫度40℃、時(shí)間2.5 h、CO2流量35 g/min、夾帶劑體積:子實(shí)體重為6:1(mL/g),在此工藝條件下,萃取物的得率為2.42%,總?cè)频牡寐蕿?.98%,萃取物中三萜的含量為40.5%。由HPLC圖譜分析可知,SFE-CO2萃取靈芝子實(shí)體三萜的過(guò)程中不同的工藝條件下獲得的萃取物中靈芝三萜的種類并沒(méi)有差異,只是在靈芝三萜的含量上有差異。但各個(gè)正交試驗(yàn)的萃取物對(duì)腫瘤細(xì)胞K562的抑制實(shí)驗(yàn)表

4、明,SFE-CO2萃取物對(duì)K562的抑制作用與萃取物中三萜的含量呈正相關(guān),最優(yōu)條件下的SFE-CO2萃取物中三萜的含量最高,高達(dá)40.5%。在作用濃度為250μg/mL時(shí),其對(duì)K562的抑制率也最高,可達(dá)71.36%。與傳統(tǒng)的醇提法相比,SFE-CO2法中粗提物和總?cè)频妮腿÷示缘?但其粗提物中三萜的含量較高,且HPLC結(jié)果顯示,SFE-CO2的粗提物中三萜的種類較多。另外,本論文還利用體外抗腫瘤、抗神經(jīng)細(xì)胞損傷和抗氧化模型比較了這兩

5、種方法獲得的萃取物生物活性的差異。結(jié)果顯示,在濃度為100μg/mL時(shí),靈芝子實(shí)體超臨界 CO2萃取物(SFE-CO2E)對(duì)腫瘤細(xì)胞 LNCaP、K562和 HepG2增殖的抑制率分別為78.37%、87.09%、78.85%,結(jié)果均高于靈芝子實(shí)體醇提物(EtOHE)的60.65%、82.29%、66.15%;在體外抗神經(jīng)細(xì)胞損傷的模型中,在濃度為200μg/mL時(shí),SFE-CO2E對(duì)PC12細(xì)胞的修復(fù)率為59.29%,優(yōu)于EtOHE的

6、17.77%;然而在清除羥基自由基、H2O2自由基和DPPH自由基的實(shí)驗(yàn)中,在濃度為800μg/mL時(shí), EtOHE對(duì)三種自由基的清除率分別為61.90%、67.33%、52.07%,結(jié)果均高于SFE-CO2E的29.24%、39.43%、17.05%。由以上結(jié)果可見(jiàn),超臨界 CO2萃取法和醇提法在萃取靈芝子實(shí)體中的不同生物活性物質(zhì)方面各有優(yōu)勢(shì)。針對(duì)中試的試驗(yàn)設(shè)備,我們還設(shè)計(jì)了超臨界 CO2萃法萃取靈芝子實(shí)體三萜的中試萃取工藝,結(jié)果如下

7、:使用夾帶劑泵連續(xù)的加入夾帶劑,靈芝子實(shí)體粒度為40目,夾帶劑即乙醇的濃度為95%,萃取壓力為35 Mpa、萃取溫度為40℃、萃取時(shí)間為100min、CO2流量為35 g/min、夾帶劑泵的行程為15mm。在此條件下SFE-CO2萃取靈芝子實(shí)體總?cè)频妮腿÷士蛇_(dá)1.66%。
　　在靈芝子實(shí)體抗前列腺癌活性成分的研究中,我們先用不同的有機(jī)溶劑,按極性從小到大對(duì)靈芝子實(shí)體的SFE-CO2E進(jìn)行分部,然后再以抑制前列腺癌細(xì)胞LNCaP增

8、殖的活性為指導(dǎo),對(duì)活性部位用硅膠柱層析、凝膠柱層析法等方法進(jìn)行分離純化,最終得到10個(gè)化合物,其中乙酸乙酯萃取部分共分離得到4個(gè)化合物(化合物1-4),氯仿萃取部分共分離得到了5個(gè)化合物(化合物1,2,8,9,10),石油醚萃取部分共分離得到了4個(gè)化合物(化合物1,5,6,7)。在這些化合物中只有化合物2有明顯的抑制LNCaP增殖的活性,在作用濃度為100μg/mL時(shí),其對(duì)LNCaP細(xì)胞增殖的抑制率可達(dá)50%以上。運(yùn)用現(xiàn)代的光譜技術(shù)(E

9、SIMS、1D NMR、2D NMR等)對(duì)獲得的化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,確定化合物1為麥角甾醇和星魚(yú)甾醇的混合物,化合物2為靈芝酮三醇,化合物3為靈芝醇 B,化合物5為 ergosta-7,22-diene-3β-yl pentadecanoate,化合物8為ergosta-7,22-diene-2β,3α,9α-triol,化合物9為靈芝醇 A?？骨傲邢侔┑幕钚愿檶?shí)驗(yàn)結(jié)果表明,靈芝子實(shí)體SFE-CO2E及其分部的各個(gè)部分都對(duì)LNCaP

10、細(xì)胞的增殖具有抑制作用,且隨著濃度升高其抑制作用也增強(qiáng)。靈芝子實(shí)體 SFE-CO2萃取物對(duì)LNCaP細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng),在作用濃度為100μg/mL時(shí),其對(duì)LNCaP細(xì)胞增殖的抑制率可達(dá)71.76%。各分部部分對(duì)LNCaP細(xì)胞增殖的抑制作用由強(qiáng)到弱依次為乙酸乙酯部分>氯仿部分>石油醚部分>正丁醇部分。乙酸乙酯部分、氯仿部分和石油醚部分分離純化所得的各個(gè)組份的抗前列腺癌活性跟蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示多個(gè)組份都具有明顯的抗前列腺癌活性。
　

11、　在靈芝子實(shí)體活性成分的研究過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn),許多粗分離組分都有很好的抗前列腺癌細(xì)胞增殖的生物活性,然而分離得到的化合物的活性卻不理想,因此我們對(duì)靈芝子實(shí)體 SFE-CO2E和四種靈芝三萜類的化合物抗前列腺癌作用的機(jī)理都進(jìn)行了初步的研究。我們運(yùn)用四唑鹽(MTT)比色法、酶聯(lián)免疫(ELISA)法和蛋白質(zhì)印跡法(Western bloting)研究了靈芝子實(shí)體的SFE-CO2E、靈芝醇B、靈芝酮三醇、靈芝酸S和靈芝酸R對(duì)雄激素依賴性前列腺癌細(xì)

12、胞株LNCaP細(xì)胞的增殖、分泌前列腺特異性抗原(PSA)和表達(dá)雄激素受體(AR)的抑制作用。另外我們還建立了HPLC法研究活性物質(zhì)對(duì)5α-還原酶的抑制作用的體外模型。建立的HPLC法檢測(cè)5α-還原酶活性的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ腿缦?色譜分離條件為YMC-Pack ODS-AQ色譜柱(5μm,250 mm×4.6 mm),流動(dòng)相:甲醇/水=75/25,流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣量為20μL;柱溫為常溫;檢測(cè)波長(zhǎng)為242 nm,睪酮(T)的出峰

13、時(shí)間為8.83 min?？傮w積為200μL的5α-還原酶催化反應(yīng)體系:待測(cè)樣品10μL,1 mM的T10μL,0.625 mg/mL大鼠肝微粒體160 mL,6 mM的NADPH20μL,37℃反應(yīng)80 min。反應(yīng)完成后加入400μL甲醇終止反應(yīng),15294 g離心30 min后取上清用0.22μm的膜過(guò)濾后上HPLC進(jìn)行分析。HPLC法檢測(cè)5α-還原酶活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示靈芝子實(shí)體SFE-CO2E、靈芝酮三醇、靈芝醇B、靈芝酸S和靈芝

14、酸R都對(duì)5α-還原酶具有明顯的抑制作用,四種靈芝三萜類化合物對(duì)其抑制作用由強(qiáng)到弱依次為靈芝酸 R>靈芝酸 S>靈芝醇B>靈芝酮三醇。MTT法檢測(cè)活性物質(zhì)對(duì)LNCaP細(xì)胞的增殖的抑制作用的結(jié)果顯示,在有或沒(méi)有雄激素睪酮(T)和雙氫睪酮(DHT)存在的條件下,靈芝子實(shí)體 SFE-CO2萃取物、靈芝酮三醇、靈芝酸 S和靈芝酸R都對(duì)LNCaP細(xì)胞的增殖有抑制作用且呈現(xiàn)濃度依賴性,但靈芝醇B只在T和DHT存在的條件下才對(duì)LNCaP細(xì)胞的增殖有抑制

15、作用且呈現(xiàn)濃度依賴性。ELISA法檢測(cè)活性物質(zhì)對(duì) LNCaP細(xì)胞分泌PSA的抑制作用的結(jié)果顯示,靈芝子實(shí)體SFE-CO2萃取物、靈芝酮三醇、靈芝醇B、靈芝酸S和靈芝酸R都對(duì)LNCaP細(xì)胞分泌PSA具有明顯的抑制作用,并且在T或DHT存在的條件下,它們對(duì)LNCaP細(xì)胞分泌PSA的抑制作用比沒(méi)有T或DHT存在時(shí)更強(qiáng)。Western bloting的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,靈芝子實(shí)體 SFE-CO2萃取物、靈芝酮三醇、靈芝醇B、靈芝酸S和靈芝酸R都能在