CD40信號(hào)聯(lián)合細(xì)胞因子體外制備過(guò)繼免疫治療細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康,雖然手術(shù)、化療和放療等治療手段不斷改進(jìn)提高,但是仍有很多患者遭罹腫瘤的復(fù)發(fā)。從腫瘤生物/免疫治療方面來(lái)打開(kāi)突破口,尋找優(yōu)化的綜合治療方案,是現(xiàn)代腫瘤治療的新途徑。腫瘤疫苗、單克隆抗體治療、細(xì)胞因子等佐劑治療和過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療是近來(lái)比較常用的腫瘤免疫治療方法。腫瘤過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療(Adoptive cellular immunotherapy,ACI或AIT)是指將體外擴(kuò)增的具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞(包括特

2、異性的和非特異性的)向腫瘤患者回輸,直接或間接激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答以殺傷腫瘤細(xì)胞,這對(duì)細(xì)胞免疫功能低下的患者特別適用,其主要的原理是在體外分離得到患者外周血單個(gè)核細(xì)胞,經(jīng)過(guò)特異性抗原作用和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)后具備了特異性或非特異性殺傷腫瘤的能力,之后將這種細(xì)胞擴(kuò)增到一定數(shù)量再回輸?shù)交颊唧w內(nèi),以預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,這在一定程度上解決了患者放、化療后免疫力差,生活質(zhì)量低的嚴(yán)重問(wèn)題,延長(zhǎng)了患者的生存時(shí)間。目前,多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞(cytoki

3、nes induced killers,CIK)已經(jīng)用于多種惡性腫瘤的輔助治療,因其兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤特點(diǎn),被認(rèn)為是腫瘤過(guò)繼免疫治療的希望,但其臨床應(yīng)用依然存在著一些亟待解決的問(wèn)題,進(jìn)一步發(fā)掘過(guò)繼免疫治療細(xì)胞潛在的抗腫瘤優(yōu)勢(shì),對(duì)于提高腫瘤過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療在腫瘤綜合治療中的地位意義深遠(yuǎn),因此本研究運(yùn)用本所自主研制的CD40激發(fā)型抗體5C11聯(lián)合細(xì)胞因子IFN-α和IL-7體外制備一種新型過(guò)繼免疫

4、治療細(xì)胞,從細(xì)胞增殖、細(xì)胞生物學(xué)特性和細(xì)胞的殺傷效應(yīng)等方面探討其過(guò)繼免疫治療的作用,以期為腫瘤過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療開(kāi)辟一種新的方案。
　　目的：比較新型方法(CD40激發(fā)組)與傳統(tǒng)方法(CD3激發(fā)組)培養(yǎng)的過(guò)繼免疫治療細(xì)胞在增殖速度、細(xì)胞亞群和生物學(xué)特性(T細(xì)胞、NK-T細(xì)胞、單核細(xì)胞、Treg/ICOS+Treg細(xì)胞和表達(dá)PD-1、CXCR-4的T細(xì)胞等)以及體外趨化能力和殺傷腫瘤細(xì)胞能力等方面的差異,以期建立體外培養(yǎng)過(guò)繼免疫治療

5、細(xì)胞的優(yōu)化方案。
　　方法：常規(guī)經(jīng)Ficoll分離正常人外周血得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),于6孔板和24孔板中加入相應(yīng)細(xì)胞因子(CD40激發(fā)組:CD40激發(fā)型單抗5C11,IFN-α, IL-7;CD3激發(fā)組:IFN-γ,IL-2,anti-CD3mAb,IL-1α)后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔兩天補(bǔ)一次細(xì)胞因子液。在培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)(第6、9、12天)記錄細(xì)胞形態(tài)并用臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)以檢測(cè)細(xì)胞增殖。在培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)

6、,運(yùn)用免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、CD14+CD56+CD11c+細(xì)胞比例,檢測(cè)T細(xì)胞表達(dá)CD62L、CCR7、CXCR-4以及PD-1的變化以及Treg和ICOS+Treg細(xì)胞的表達(dá)比例。收集培養(yǎng)第9天的細(xì)胞,利用Transwell板檢測(cè)體外培養(yǎng)的過(guò)繼免疫治療細(xì)胞的體外趨化能力。在培養(yǎng)的第9天收集兩組體外培養(yǎng)的過(guò)繼免疫治療細(xì)胞,將其與人肺癌細(xì)胞株A549按照不同的效靶比共同培養(yǎng)72小時(shí)后,用CCK-8

7、法檢測(cè)體外培養(yǎng)的過(guò)繼免疫治療細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。
　　結(jié)果：⑴CD3激發(fā)組和CD40激發(fā)組細(xì)胞都出現(xiàn)明顯的集落樣生長(zhǎng),CD40激發(fā)組細(xì)胞增殖速度略慢,但二者沒(méi)有顯著性差異;⑵CD3激發(fā)組和CD40激發(fā)組細(xì)胞在T淋巴細(xì)胞組成上無(wú)顯著差異,CD40激發(fā)組的NK-T細(xì)胞表達(dá)顯著上調(diào),中央型記憶CD8+T細(xì)胞(CD8+TCM)的比例增加,并且在培養(yǎng)的特定時(shí)間出現(xiàn)了獨(dú)特的CD14+CD56+CD11c+細(xì)胞群體;⑶和 CD3激發(fā)組相比,

8、CD40激發(fā)組的Treg細(xì)胞、ICOS+Treg細(xì)胞和表達(dá)PD-1的T細(xì)胞比例顯著降低;⑷CD40激發(fā)組培養(yǎng)的過(guò)繼免疫治療細(xì)胞在第9天時(shí),體外趨化能力強(qiáng),并且對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞的殺傷活性不亞于CD3激發(fā)組。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)所建立的新型過(guò)繼免疫治療細(xì)胞體外培養(yǎng)方法能提高培養(yǎng)細(xì)胞中NK-T細(xì)胞的比例,顯著減少Treg細(xì)胞的數(shù)量,并且在培養(yǎng)的特定時(shí)間出現(xiàn)了獨(dú)特的CD14+CD56+CD11c+細(xì)胞群體,為腫瘤過(guò)繼免疫治療新方案