γδT細(xì)胞免疫治療骨肉瘤的臨床前研究.pdf

1、骨肉瘤為兒童和青少年最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，約占原發(fā)性骨惡性腫瘤的20％和惡性腫瘤的0.5％。隨著新輔助化療的應(yīng)用，對(duì)于局部肢體骨肉瘤患者生存率得到明顯改善，5年生存率已上升到65％～75％。但對(duì)于發(fā)生肺轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)的骨肉瘤患者預(yù)后極差，至今尚無(wú)有效方法。
　　 免疫治療是繼手術(shù)、化療之后，治療骨肉瘤的綜合治療手段之一。γδT細(xì)胞是人體內(nèi)固有免疫中的一個(gè)重要T細(xì)胞群；表現(xiàn)為CD4-CD8-“雙陰性”表型，對(duì)抗原的識(shí)別無(wú)MHC限

2、制性，無(wú)需抗原提呈細(xì)胞提呈；具有確鑿的廣譜殺滅腫瘤細(xì)胞功能。然而，γδT細(xì)胞對(duì)骨肉瘤的作用目前研究較少。在本次研究中，我們探討了γδT細(xì)胞免疫治療骨肉瘤的作用及可能涉及的途徑。
　　 本次研究主要分三部分：一、首先以健康人和骨肉瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞為研究對(duì)象，應(yīng)用Zol和IL-2聯(lián)合刺激，獲得高純度的γδT細(xì)胞擴(kuò)增。重要的是該方法獲得的γδT細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。二、在第一部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們探索了γδT細(xì)胞及與唑來(lái)膦酸聯(lián)合抗骨

3、肉瘤細(xì)胞的能力與途徑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)γδT細(xì)胞具有抗骨肉瘤能力，并且與唑來(lái)膦酸聯(lián)合效果更好。三、在裸鼠中建立骨肉瘤的動(dòng)物模型，觀察了γδT細(xì)胞在動(dòng)物模型中對(duì)骨肉瘤的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)γδT細(xì)胞具有抑制骨肉瘤增殖能力，并且與唑來(lái)膦酸聯(lián)合效果更好。我們的研究結(jié)果表明，γδT細(xì)胞具有抗骨肉瘤的作用。
　　 第一部分γδT細(xì)胞的制備及殺傷活性
　　 目的：
　　 建立外周血單個(gè)核細(xì)胞體外擴(kuò)增γδT細(xì)胞的方法。
　　 方法：

4、
　　 不同來(lái)源的外周血單核細(xì)胞分別使用IL-2和Zol+IL-2刺激體外擴(kuò)增，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)γδT細(xì)胞的純度，以Daudi細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照、Raji細(xì)胞為陰性對(duì)照，并以人成骨細(xì)胞系hFOB細(xì)胞作為正常對(duì)照，用LDH法檢測(cè)擴(kuò)增后γδT細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。
　　 結(jié)果：
　　 健康人和骨肉瘤患者外周血單核細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外14天的培養(yǎng)，Zol+IL-2組可高度選擇性擴(kuò)增γδT細(xì)胞，并且擴(kuò)增后γδT細(xì)胞具有殺傷活性，而對(duì)正

5、常細(xì)胞無(wú)殺傷活性。
　　 結(jié)論：
　　 在體外，Zol和IL-2刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞可以高度選擇性擴(kuò)增γδT細(xì)胞。
　　 第二部分γδT細(xì)胞殺傷骨肉瘤細(xì)胞的體外研究
　　 目的：
　　 探討γδT細(xì)胞及其聯(lián)合唑來(lái)膦酸在體外殺傷骨肉瘤細(xì)胞的活性及其識(shí)別和殺傷骨肉瘤細(xì)胞的途徑。
　　 方法：
　　 應(yīng)用LDH法檢測(cè)不同來(lái)源的γδT細(xì)胞在體外殺傷骨肉瘤細(xì)胞和唑來(lái)膦酸預(yù)處理骨肉瘤細(xì)胞的活性

6、；以ELISA方法檢測(cè)γδT細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞共培養(yǎng)上清中的IFN-γ；應(yīng)用不同阻斷劑分別阻斷γδT細(xì)胞以觀察其殺傷骨肉瘤細(xì)胞的途徑。
　　 結(jié)果：
　　 1.不同來(lái)源的γδT細(xì)胞在體外對(duì)骨肉瘤細(xì)胞具有一定的殺傷活性，但來(lái)源于復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者殺傷活性較低；唑來(lái)膦酸可顯著增強(qiáng)γδT細(xì)胞的殺傷作用。
　　 2.骨肉瘤細(xì)胞可刺激γδT細(xì)胞分泌IFN-γ。
　　 3.γδT細(xì)胞識(shí)別、殺傷Zol預(yù)處理骨肉瘤細(xì)

7、胞主要通過(guò)TCR途徑和穿孔素-溶酶途徑，NKG2D途徑和TRAIL途徑發(fā)揮作用較小。
　　 結(jié)論：
　　 γδT細(xì)胞具有抗骨肉瘤作用。
　　 第三部分γδT細(xì)胞的體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：
　　 γδT細(xì)胞的體內(nèi)抑瘤活性。
　　 方法：
　　 裸鼠皮下注射骨肉瘤細(xì)胞建立腫瘤活體模型，動(dòng)物分為對(duì)照組、單獨(dú)Zol組、單獨(dú)γδ細(xì)胞組和Zol+γδT細(xì)胞聯(lián)合治療組，尾靜脈注射途徑接受治