瘤內(nèi)應(yīng)用免疫激活劑增強(qiáng)微波消融治療肝癌免疫效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌( hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在世界上居惡性腫瘤的第五位，而在我國(guó)則占據(jù)惡性腫瘤死亡率的第二位。外科手術(shù)切除，熱消融和肝移植是目前肝癌根治性治療的主要手段，其中以手術(shù)切除為金標(biāo)準(zhǔn)。但是，超過(guò)70％的患者在初次就診時(shí)因腫瘤進(jìn)展或肝功能不全而無(wú)法接受手術(shù)治療，而且手術(shù)后復(fù)發(fā)率高，復(fù)發(fā)后再切除機(jī)會(huì)低，外科治療的應(yīng)用受到嚴(yán)重限制。熱消融具有創(chuàng)傷小、并發(fā)癥少、可反復(fù)多次進(jìn)行等

2、優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為部分不可手術(shù)或者不宜手術(shù)治療的肝癌及術(shù)后復(fù)發(fā)的主要治療手段。但是肝癌行消融治療后復(fù)發(fā)率仍較高，因此，如何降低消融術(shù)后的復(fù)發(fā)率是提高消融治療效果的關(guān)鍵。
　　 機(jī)體對(duì)腫瘤不能產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)是腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的最主要原因?？鼓[瘤免疫需要腫瘤抗原、抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cells，APCs)和效應(yīng)細(xì)胞的參與。既往研究發(fā)現(xiàn)消融后局部可以產(chǎn)生大量的腫瘤抗原，機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)大的、可抑制腫瘤進(jìn)展的免疫

3、效應(yīng)。既往研究還發(fā)現(xiàn)，局部高濃度的細(xì)胞因子能夠顯著放大已產(chǎn)生的抗腫瘤免疫。將大劑量的生物活性細(xì)胞因子(IL-2，IL-12等)注入小鼠活體瘤內(nèi)，結(jié)果產(chǎn)生了保護(hù)性免疫，顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)。我們已經(jīng)成功地建立含有小劑量白介素-2(interleukin-2，IL-2)和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)的緩釋微球。以此作為免疫激活劑，可

4、以刺激機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)大的免疫效應(yīng)。在前期研究基礎(chǔ)上，我們建立了皮下肝癌模型，在微波消融治療的基礎(chǔ)上應(yīng)用免疫激活劑，以觀察其對(duì)機(jī)體免疫效應(yīng)的影響。
　　 第一部分建立小鼠皮下移植型肝癌消融模型
　　 材料和方法:
　　 1.小鼠皮下移植型肝癌模型的建立：常規(guī)體外培養(yǎng)小鼠Hepa1-6肝癌細(xì)胞，按接種細(xì)胞數(shù)量不同對(duì)小鼠分組。于C57BL/6J小鼠右側(cè)脅腰部皮下接種Hepa1-6細(xì)胞，建立小鼠皮下移植型肝癌模型，觀察成瘤

5、率，篩選出建立消融的模型最佳細(xì)胞數(shù)量。切除皮下移植瘤體做病理檢查。
　　 2.將最佳數(shù)量細(xì)胞注射在C57BL/6J小鼠右側(cè)脅腰部，觀察皮下腫瘤生長(zhǎng)。繪制小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)曲線，建立適合消融的小鼠皮下移植肝癌模型。
　　 3.運(yùn)用已建立C57BL/6J小鼠Hepa1-6細(xì)胞皮下移植肝癌模型，觀察不同消融時(shí)間與瘤內(nèi)溫度或瘤緣溫度的關(guān)系，以及不同消融條件下行微波消融后小鼠皮下肝癌移植瘤的30d殘瘤率。
　　 結(jié)果:<

6、br>　　 1.皮下注射小鼠Hepa1-6肝癌細(xì)胞建立小鼠皮下移植型肝癌模型，適合消融的接種細(xì)胞數(shù)量最佳選擇為2×106。
　　 2.接種Hepa1-6細(xì)胞后第10 d，小鼠皮下肝癌長(zhǎng)徑達(dá)到6-8 mm，達(dá)到消融的要求。
　　 3.隨消融時(shí)間延長(zhǎng)，瘤內(nèi)及瘤緣溫度升高，55℃3min的消融條件能有效滅活小鼠的皮下移植瘤。病理檢查提示消融后腫瘤組織呈壞死干痂樣物，鏡下未見(jiàn)活的癌細(xì)胞。消融后腫瘤結(jié)節(jié)在第八周內(nèi)完全消退。

7、>　　 結(jié)論:
　　 1、建立了小鼠皮下肝癌消融模型
　　 2、初步掌握了皮下肝癌的最佳消融條件。
　　 第二部分免疫激活劑對(duì)熱消融后淋巴細(xì)胞增殖的刺激作用
　　 材料和方法:
　　 1.設(shè)立兩個(gè)對(duì)照組：微波消融( MWA)后瘤內(nèi)注射PBS組和MWA后瘤內(nèi)注射CytoMPS組，按照第一部分條件建立皮下肝癌消融模型。
　　 2.制備細(xì)胞因子緩釋微球( CytoMPS)，消融后第3、7、10

8、天瘤內(nèi)注射CytoMPS。
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞變化：CytoMPS第三次注射后3天后處死小鼠，摘除眼球，經(jīng)眼動(dòng)脈取血，肝素抗凝處理，1小時(shí)內(nèi)送流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞變化。
　　 結(jié)果:
　　 MWA后原位注射CytoMPS組血液中的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞明顯高于MWA后注射PBS組(P<0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 MWA后應(yīng)用免疫

9、激活劑(CytoMPS)對(duì)外周血的淋巴細(xì)胞增殖有明顯的刺激作用。
　　 第三部分免疫激活劑對(duì)熱消融后淋巴細(xì)胞功能的增強(qiáng)作用
　　 材料和方法
　　 1.設(shè)立兩個(gè)對(duì)照組：MWA后注射PBS組和MWA-ISV組，按照第一部分條件建立皮下肝癌消融模型。
　　 2.制備細(xì)胞因子緩釋微球(CytoMPS)，進(jìn)行消融后第3、7、10天瘤內(nèi)注射CytoMPS。
　　 3.疫苗誘導(dǎo)體外CTL的殺瘤活性檢測(cè)：Cyt