機(jī)械性神經(jīng)元損傷后自噬的功能及Homer1a通過PI3K-Akt通路對(duì)其調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究背景:
　　創(chuàng)傷性腦損傷(Traumaticbraininjury,TBI)是一種常見的高致殘致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,分為原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷,原發(fā)性腦損傷可以通過加強(qiáng)預(yù)防來(lái)減少發(fā)生,而由原發(fā)性損傷所繼發(fā)的一系列腦損害必須通過藥物干預(yù)來(lái)改善。目前認(rèn)為,繼發(fā)性腦損傷的主要機(jī)制包括氧自由基的生成、興奮性毒性氨基酸釋放、鈣離子超載和炎癥反應(yīng)等,已有研究表明,這些機(jī)制與突觸致密物質(zhì)(postsynapticdensity,PSD

2、)和突觸間信號(hào)傳遞密切相關(guān)。Homer蛋白家族分子主要存在于哺乳動(dòng)物神經(jīng)元PSD中,與其它PSD蛋白相互作用,在不同的腦組織和結(jié)構(gòu)中發(fā)揮著不一樣的功能。Homer1b/c是Homer1蛋白的亞型之一,為PSD中的重要支架蛋白,本課題組前期研究證實(shí),離體神經(jīng)元TBI后Homer1b/c呈持續(xù)穩(wěn)定表達(dá),下調(diào)Homer1b/c明顯降低離體神經(jīng)元TBI導(dǎo)致的損害,可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體途徑在一定程度上減弱外源性谷氨酸導(dǎo)致的皮層神經(jīng)元損傷;由即早

3、基因(immediate-earlygene,IEG)編碼的另一種Homer1蛋白亞型Homer1a在離體神經(jīng)元TBI后呈動(dòng)態(tài)高表達(dá),過表達(dá)Homer1a在過氧化氫誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)性作用。
　　自噬(Autophagy)是一種生物進(jìn)化保守的溶酶體降解途徑,能夠清除細(xì)胞內(nèi)異?；蚬δ苷系K的大分子或細(xì)胞器,來(lái)維持細(xì)胞能量平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。目前認(rèn)為,適當(dāng)?shù)淖允蓪?duì)細(xì)胞有保護(hù)作用,自噬過少或過多對(duì)細(xì)胞均有損害作用。大量研究表明

4、,自噬在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中廣泛存在,并發(fā)揮重要作用。TBI后有顯著自噬發(fā)生,但其功能和調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。本課題研究了自噬在神經(jīng)元機(jī)械性損傷中的發(fā)生規(guī)律和功能,以及Homer1a蛋白對(duì)神經(jīng)元機(jī)械性損傷誘導(dǎo)自噬的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。
　　第一部分神經(jīng)元機(jī)械性損傷后自噬的發(fā)生規(guī)律
　　目的：明確小鼠大腦皮層離體神經(jīng)元機(jī)械性損傷后自噬的發(fā)生規(guī)律。方法：(1)細(xì)胞培養(yǎng):昆明小鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng);(2)建立模型:建立穩(wěn)定可靠的離體神經(jīng)元機(jī)械

5、性損傷模型模擬創(chuàng)傷性腦損傷;(3)細(xì)胞自噬監(jiān)測(cè):采用Westernblot檢測(cè)LC3Ⅱ和Beclin-1的表達(dá);采用透射電鏡觀察神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)自噬小體和自噬溶酶體數(shù)量;使用免疫熒光法檢測(cè)LC3,觀察自噬小體的數(shù)量變化;(4)自噬的干預(yù):使用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素和自噬抑制劑3-MA干預(yù)自噬。結(jié)果：小鼠大腦皮層離體神經(jīng)元機(jī)械性損傷后3h自噬標(biāo)志性相關(guān)分子LC3Ⅱ表達(dá)開始增加,且隨時(shí)間變化逐漸增高;損傷組神經(jīng)元Beclin-1分子表達(dá)顯著高于對(duì)

6、照組,但無(wú)明顯時(shí)間變化趨勢(shì)。免疫熒光法檢測(cè)LC3證明,損傷后24h神經(jīng)元自噬明顯增加。電鏡可見,離體神經(jīng)元機(jī)械性損傷后24h胞質(zhì)內(nèi)有大量自噬小體或自噬溶酶體。結(jié)論：離體神經(jīng)元機(jī)械性損傷后有顯著自噬發(fā)生。
　　第二部分PI3K-Akt信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)元機(jī)械性損傷后自噬的調(diào)節(jié)作用
　　目的：研究PI3K-Akt信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)元機(jī)械性損傷誘導(dǎo)自噬的調(diào)節(jié)作用。方法：(1)抑制PI3K-Akt信號(hào)通路:使用三個(gè)不同濃度(12.5μM、2

7、5μM和50μM)的PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理,采用Westernblot檢測(cè)p-Akt來(lái)探索最佳抑制濃度;(2)自噬的干預(yù):使用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素和自噬抑制劑3-MA干預(yù)自噬;(3)自噬檢測(cè):采用Westernblot檢測(cè)LC3Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)。結(jié)果：神經(jīng)元機(jī)械性損傷后1hp-Akt表達(dá)開始增高,3h達(dá)到峰值,之后趨于下降,在24h基本回到正常水平;濃度為25μM的LY294002對(duì)PI3K抑制效果最明顯,抑制PI

8、3K后p-Akt顯著下調(diào),同時(shí)LC3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)顯著增高。結(jié)論：PI3K-Akt信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)元機(jī)械性損傷后自噬有負(fù)調(diào)節(jié)作用。
　　第三部分神經(jīng)元機(jī)械性損傷誘導(dǎo)自噬的作用和功能
　　目的：探索自噬在神經(jīng)元機(jī)械性損傷后的作用和功能。方法：(1)神經(jīng)元機(jī)械性損傷程度檢測(cè):采用LDH試劑盒、MTT法檢測(cè)神經(jīng)元活性;(2)自噬的干預(yù):使用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素和自噬抑制劑3-MA干預(yù)自噬;(3)自噬檢測(cè):采用Westernb

9、lot檢測(cè)LC3Ⅱ和Beclin-1的表達(dá);(4)凋亡檢測(cè):采用Westernblot檢測(cè)cleaved-Caspase3、Caspase3;TUNEL染色。結(jié)果：無(wú)論損傷前1h還是損傷后1h抑制自噬,LDH值均增高,損傷前抑制自噬神經(jīng)元釋放LDH的值較損傷后抑制自噬略高;無(wú)論損傷前1h還是損傷后1h抑制自噬,MTT值均降低,且損傷前抑制自噬比損傷后抑制自噬MTT值略低。損傷前1h激動(dòng)自噬,神經(jīng)元LDH釋放增高,損傷后1h激動(dòng)自噬LDH

10、值則較對(duì)照組明顯降低;MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性,結(jié)果顯示損傷前1h激動(dòng)自噬,神經(jīng)元MTT值高于對(duì)照組,損傷后1h激動(dòng)自噬MTT值則明顯低于對(duì)照組。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),損傷后1h抑制自噬,損傷后24h神經(jīng)元cleaved-Caspase3表達(dá)降低,TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞減少;損傷后1h激動(dòng)自噬,損傷后24h神經(jīng)元cleaved-Caspase3表達(dá)升高,TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞增加。結(jié)論：無(wú)論在神經(jīng)元機(jī)械性損傷前1h還是損傷后1h抑制自噬,均降低神經(jīng)元活性

11、;神經(jīng)元機(jī)械性損傷前1h激動(dòng)自噬細(xì)胞活性較對(duì)照組無(wú)顯著差異,而損傷后1h激動(dòng)自噬細(xì)胞活性明顯改善。損傷后1h抑制自噬,神經(jīng)元凋亡減少;損傷后1h激動(dòng)自噬,神經(jīng)元凋亡增加。
　　第四部分Homer1a對(duì)神經(jīng)元機(jī)械性損傷后自噬的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制
　　目的：探索Homer1a對(duì)神經(jīng)元機(jī)械性損傷后自噬的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。方法：(1)Homer1a調(diào)節(jié):構(gòu)建Homer1a過表達(dá)和干涉載體,通過慢病毒轉(zhuǎn)染來(lái)上調(diào)和下調(diào)Homer1a表達(dá);(2

12、)自噬的干預(yù):使用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素和自噬抑制劑3-MA干預(yù)自噬;(3)抑制PI3K-Akt信號(hào)通路:使用濃度為25μM的PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理;(4)分子表達(dá):采用Westernblot檢測(cè)活化Homer1a、p-Akt、T-Akt、LC3Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)。結(jié)果：皮層神經(jīng)元機(jī)械性損傷后1hHomer1a蛋白表達(dá)開始增加,6h為表達(dá)高峰,之后趨于下降;免疫熒光法檢測(cè)可見,損傷后6hHomer1a蛋白在神經(jīng)元上表達(dá)

13、顯著高于對(duì)照組,主要分布于胞質(zhì)的胞膜側(cè)和突起。過表達(dá)Homer1a可使損傷后神經(jīng)元p-Akt表達(dá)降低,同時(shí)LC3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)升高,細(xì)胞活性改善;干涉Homer1a可使損傷后神經(jīng)元p-Akt表達(dá)升高,LC3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)降低,細(xì)胞活性降低。使用LY294002抑制PI3K,損傷神經(jīng)元Homer1a蛋白表達(dá)上調(diào);使用3-MA抑制自噬,損傷神經(jīng)元Homer1a蛋白表達(dá)下調(diào),使用雷帕霉素激動(dòng)自噬,損傷神經(jīng)元Homer1a蛋