大鼠LASS1的克隆和表達(dá)及其與神經(jīng)元衰老相關(guān)性的初步研究.pdf

1、背景與目的:
　　LAG1基因是在酵母中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)與長(zhǎng)壽相關(guān)的基因,其表達(dá)水平隨著酵母細(xì)胞傳代衰老明顯下降,敲除或過(guò)量表達(dá)可使酵母?jìng)鞔鷫勖l(fā)生改變]。LASS1基因是存在于哺乳動(dòng)物和人類中的LAG1的同源基因,它主要在腦組織、骨骼肌和睪丸組織中表達(dá)。目前研究認(rèn)為L(zhǎng)AG1編碼蛋白(Lag1p)及其同源蛋白與含不同脂肪酸鏈的神經(jīng)酰胺合成密切相關(guān),Lass1p調(diào)節(jié)C18:0-神經(jīng)酰胺合成[5,6],后者是哺乳動(dòng)物腦中鞘脂類的主要成分[

2、7,8],鑒于神經(jīng)酰胺作為信號(hào)因子的重要作用[9,10],推測(cè)LASS1參與神經(jīng)元衰老等生理過(guò)程。本研究目的在于:
　　(1)克隆大鼠LASS1 mRNA全長(zhǎng)cDNA序列并進(jìn)行分析;
　　(2)研究LASS1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在正常大鼠腦皮層神經(jīng)元衰老過(guò)程中的變化;
　　(3)將全長(zhǎng)及部分LASS1 cDNA序列克隆至原核表達(dá)載體,進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá),純化的表達(dá)融合蛋白免疫動(dòng)物制作抗體,為探討LASS1在神經(jīng)元衰老等生理過(guò)

3、程中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　材料和方法:
　　(1)從大鼠頂葉皮層神經(jīng)組織提取總 RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA第一鏈,根據(jù)Genebank上大鼠LASS1mRNA預(yù)測(cè)序列,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增克隆全長(zhǎng)cDNA序列,并對(duì)其序列保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行同源性分析。
　　(2)半定量RT-PCR、熒光定量PCR和Northern方法探討大鼠LASS1基因表達(dá)隨年齡變化。分別從胎鼠、新生鼠、1月齡、3月齡、6月齡、11月齡、18月齡和24月齡鼠大

4、腦皮層組織提取總RNA,RT-PCR擴(kuò)增獲得LASS1的cDNA第一鏈,進(jìn)行半定量擴(kuò)增、電泳和信號(hào)強(qiáng)度分析;以重組質(zhì)粒載體為定量標(biāo)準(zhǔn)模板,采用Taqman熒光探針,在Prism7700熒光檢測(cè)儀上,一步法實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)LASS1 mRNA表達(dá);生物素標(biāo)記基因特異性探針雜交并用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行Northern blot;以18S rRNA基因作為看家基因。
　　(3)設(shè)計(jì)擴(kuò)增LASS1 cDNA片段序列的引物,PCR擴(kuò)增后連

5、入pET41表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá),融合蛋白經(jīng)Ni-NTA親和層析純化,SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物的分子量及純化效果。用純化的融合蛋白免疫家兔及豚鼠,獲得抗血清,采用Western blot法對(duì)抗體特異性進(jìn)行分析鑒定。
　　結(jié)果:
　　(1)大鼠LASS1基因的cDNA序列包含兩個(gè)不重合的開放閱讀框(ORF),LASS1基因的ORF位于上游[4],包含1053bp,與Genebank上預(yù)

6、測(cè)序列有所不同,編碼蛋白由350個(gè)氨基酸序列組成,含有Lag1蛋白家族保守的Lag1p motif和TLC區(qū)域[3,11],C-末端存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保守信號(hào)(KDKLF)[12]。
　　(2)半定量結(jié)果顯示新生鼠、老年鼠中LASS1表達(dá)量低于成年鼠(1M,6M,12M);熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示從胎鼠、新生鼠至1~3月鼠,LASS1表達(dá)量逐漸增高達(dá)高峰,之后逐漸隨年齡增長(zhǎng)衰老而表達(dá)降低;Northern blot結(jié)果顯示與前面定量結(jié)

7、果基本一致,LASS1表達(dá)量在新生鼠和老年鼠中表達(dá)水平降低。
　　(3)LASS1 cDNA全長(zhǎng)序列不能在原核表達(dá)載體 pET-41中表達(dá),選取兩段膜外區(qū)片段構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)測(cè)序證明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確,表達(dá)融合蛋白與預(yù)期大小相符。用該融合蛋白免疫家兔均獲得相應(yīng)多克隆抗體,該抗體與重組蛋白明顯反應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　(1)成功分離和克隆出大鼠LASS1基因mRNA序列,并在Genebank登錄(登錄號(hào)DQ479969)