顱腦損傷繼發(fā)性神經(jīng)元凋亡中AEP的表達及其與凋亡因子Casepase-3和Casepase-9表達相關(guān)性的研究.pdf

1、蛋白酶對顱腦損傷后繼發(fā)性神經(jīng)元的損傷和凋亡的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要，而對其復(fù)雜的分子調(diào)控機制的研究更可為減輕創(chuàng)傷性腦損傷后病理損害的程度，促進神經(jīng)功能恢復(fù)提供新靶點和新策略。天冬酰胺內(nèi)肽酶（Asparaginyl endopeptidase，AEP）是一種新近發(fā)現(xiàn)的蛋白酶，目前有多項研究報道AEP可在應(yīng)激狀態(tài)下表達，且在缺氧條件下可能表達顯著。同時也有實驗證實AEP在大鼠MCAO模型中可能參與免疫細(xì)胞侵入的機制。然而，在顱腦損傷方面AEP的功

2、能與分子機理仍是研究空白。我們在本實驗研究中采用了小鼠控制性腦皮質(zhì)撞擊模型，并通過GFAP染色和退變神經(jīng)元Fluoro-Jade B組織熒光染色檢測海馬CA2，CA3區(qū)細(xì)胞凋亡情況，并結(jié)合Western-blot技術(shù)檢測AEP及凋亡關(guān)鍵因子Caspase-3及Caspase-9的表達變化。試圖證明AEP與創(chuàng)傷性顱腦損傷后神經(jīng)元的凋亡相關(guān)，其作用機制可能通過Caspase-3及Caspase-9等凋亡關(guān)鍵蛋白得以實現(xiàn)。
　　本實驗分

3、為三部分：第一部分：AEP基因剔除小鼠皮質(zhì)打擊中度損傷模型的建立；第二部分：AEP與中度顱腦損傷小鼠海馬神經(jīng)元繼發(fā)性凋亡相關(guān)性的研究；第三部分：中度顱腦損傷小鼠繼發(fā)性神經(jīng)元凋亡中AEP的表達及其與凋亡因子Caspase-3和Caspase-9表達相關(guān)性的研究。
　　第一部分：AEP基因剔除小鼠控制性皮質(zhì)打擊損傷模型的建立
　　目的：建立穩(wěn)定的AEP基因剔除（gene knockout，KO）小鼠皮質(zhì)打擊腦損傷（control

4、led cortical impact，CCI）動物模型。評估致傷模型的有效性及傷后腦的改變是否符合實驗要求。為深入開展創(chuàng)傷性顱腦損傷的相關(guān)動物實驗研究奠定堅實的基礎(chǔ)。
　　方法：
　　實驗動物及分組：雄性AEP基因剔除的C57Bl/6小鼠40只，隨機分為：假損傷組(n＝10)；輕度腦損傷組(n＝10)；中度腦損傷組(n＝10)；重度腦損傷組(n＝10)。
　　皮質(zhì)打擊腦損傷AEP基因剔除小鼠模型的建立：各組動物均使用

5、直徑3mm的打擊頭，進行持續(xù)180ms的打擊，輕度損傷組打擊參數(shù)：打擊速度1.5m/s，打擊深度1mm，中度損傷組打擊參數(shù)：打擊速度3m/s,打擊深度1mm，重度損傷組打擊參數(shù)：打擊速度3m/s，打擊深度2mm。假損傷組小鼠僅做致傷前準(zhǔn)備而不予以打擊。
　　所有實驗組動物在損傷前15分鐘至損傷后4小時均行各項生理參數(shù)檢測，每組各4只分別在皮質(zhì)打擊顱腦傷前后完成神經(jīng)反射時間評分測試，另取每組各3只于傷后24h行組織病理學(xué)分析（H&E

6、染色）。
　　結(jié)果：所有實驗動物生理參數(shù)均在正常范圍內(nèi)波動無統(tǒng)計差異。神經(jīng)反射時間結(jié)果顯示在損傷后隨打擊強度增大，致傷小鼠的反射時間明顯增加（P<0.01）。組織病理學(xué)分析顯示隨打擊強度增大小鼠致傷灶周圍皮層和海馬腦損傷程度遞增并且神經(jīng)元損傷有明顯差異。
　　結(jié)論：上述實驗結(jié)果顯示該動物打擊模型符合臨床上顱腦損傷患者的病理學(xué)改變和病理生理特點。我們成功地建立了AEP基因剔除小鼠皮質(zhì)打擊腦損傷的模型，為下一步探索TBI后AEP

7、的表達及其與神經(jīng)元凋亡相關(guān)因子CASEPASE-3表達相關(guān)性的研究提供了良好的基礎(chǔ)條件。
　　第二部分：AEP與顱腦損傷小鼠海馬神經(jīng)元繼發(fā)性凋亡相關(guān)性的研究
　　目的:探討AEP與顱腦損傷小鼠海馬神經(jīng)元繼發(fā)性凋亡的相關(guān)性。
　　方法:在前期成功采用CCI打擊裝置，建立AEP基因剔除小鼠腦損傷模型基礎(chǔ)上，小鼠分為4組（n=30/組）：野生型（wild type，WT）假損傷組，野生型損傷組和基因剔除假損傷組,基因剔除損傷

8、組。并通過GFAP染色和退變神經(jīng)元Fluoro-Jade B組織熒光染色檢測,分析海馬CA2，CA3區(qū)域細(xì)胞凋亡情況，以探討AEP與顱腦損傷小鼠海馬神經(jīng)元繼發(fā)性凋亡的相關(guān)性。
　　結(jié)果：CCI前WT假損傷組與KO假損傷組在CA2，CA3區(qū)域膠質(zhì)細(xì)胞平均密度無顯著差異（P>0.05）,CCI后24h WT損傷組與KO損傷組在CA2，CA3區(qū)域膠質(zhì)細(xì)胞平均密度有顯著差異（P<0.05）。CCI后小鼠打擊同側(cè)CA2，CA3區(qū)域退變神經(jīng)元

9、密度統(tǒng)計方法同前，KO組小鼠CCI后CA2，CA3區(qū)域退變神經(jīng)元平均密度68.78個/mm2；WT組小鼠CCI后CA2，CA3區(qū)域退變神經(jīng)元平均密度44.82個/mm2。WT組和KO組小鼠CCI后CA2，CA3區(qū)域退變神經(jīng)元平均密度有顯著差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論：CCI后的繼發(fā)性腦損傷能夠?qū)е聯(lián)p傷同側(cè)海馬CA2，CA3區(qū)域神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)AEP基因剔除小鼠的凋亡細(xì)胞數(shù)量較對照組明顯增加，提示AEP可能與T

10、BI后神經(jīng)元凋亡相關(guān)。
　　第三部分：顱腦損傷繼發(fā)性神經(jīng)元凋亡中AEP的表達及其與凋亡因子Casepase-3和Caspase-9表達相關(guān)性的研究
　　目的：探討顱腦損傷小鼠繼發(fā)性神經(jīng)元凋亡中AEP的表達及其與凋亡因子Caspase-3和Caspase-9表達的相關(guān)性。
　　方法：在前期發(fā)現(xiàn)AEP與TBI損傷同側(cè)海馬CA2，CA3區(qū)域細(xì)胞凋亡程度相關(guān)的工作基礎(chǔ)上，將雄性C57BL/6小鼠野生型75只隨機分入5組，0小時

11、（n=5），0.5小時組（n=5），1小時組（n=5），2小時組（n=5），4小時組（n=5），每組5只動物?？刂菩云べ|(zhì)打擊損傷模型制作、標(biāo)本采集同第一部分，取新鮮標(biāo)本后行Western-blot檢測各組動物AEP的表達，并重復(fù)三次予以驗證。各組動物每個時間段行Western-blot檢測AEP在蛋白水平的表達變化。雄性C57/BL小鼠野生型15只，雄性C57/BL小鼠AEP基因剔除型小鼠15只，隨機選取不同基因型小鼠各5只，分為兩組。

12、控制性皮質(zhì)打擊損傷模型制作、標(biāo)本采集同第一部分，取新鮮標(biāo)本后行Western-blot檢測兩組動物Caspase-3及Caspase-9的表達，并重復(fù)三次予以驗證。
　　結(jié)果：AEP在CCI造成WT小鼠中度顱腦損傷后0小時即有表達，隨時間推移AEP的表達在1h時明顯降低（p<0.05），在2h時表達再次增高，隨時間延長至4h時表達消失（p<0.05）。CCI后4h時斷頭取腦。結(jié)果顯示兩組小鼠CCI后均有Caspase-3，Casp

13、ase-9表達，WT組小鼠CCI后Caspase-3，Caspase-9的活化程度較AEP基因剔除小鼠為低，表達程度較高(p<0.05)。
　　結(jié)論：本研究證實在CCI后AEP的表達與神經(jīng)元的繼發(fā)性凋亡相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)AEP的表達與凋亡因子Caspase-3和Caspase-9的表達程度相關(guān)，提示AEP可能通過對Caspase-3和Caspase-9的調(diào)控對神經(jīng)元凋亡產(chǎn)生抑制作用。因此，本研究為通過多途徑、多機制而作用于多靶點的腦保