大鼠顱腦損傷后GFAP、S100B的表達(dá)與損傷時(shí)間的相關(guān)性研究.pdf

1、背景和目的：
　　創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury TBI)系作用力直接或間接作用于頭部引起的腦組織損傷，是復(fù)雜且嚴(yán)重的中樞神經(jīng)損傷。隨著當(dāng)今社會(huì)發(fā)展，社會(huì)活動(dòng)的不斷增加，顱腦損傷案件頻發(fā)。主要為交通事故傷、建筑工地傷、高墜傷、中老年摔傷等。TBI的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，它是由原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷共同作用的結(jié)果。目前在臨床上對(duì)于TBI損傷機(jī)制以及治療預(yù)后的研究上有一定進(jìn)展，也可以根據(jù)CT、MRI對(duì)TBI進(jìn)

2、行傷情判斷。在法醫(yī)學(xué)中，對(duì)于TBI的研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)是確定損傷時(shí)間。傳統(tǒng)上，判定損傷時(shí)間主要依據(jù)TBI后的病理形態(tài)行為及改變，但此方法主觀性太強(qiáng)，對(duì)損傷時(shí)間的判斷也不夠精確。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷提高，通過生物標(biāo)記物的檢測(cè)確定損傷時(shí)間成為法醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)。星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)損傷中起著至關(guān)重要的作用，其中GFAP、S100B都是星形膠質(zhì)細(xì)胞中的特異性標(biāo)記物，也參與腦損傷后的免疫反應(yīng)、修復(fù)等。
　　本實(shí)驗(yàn)通過建立顱腦損傷模型，應(yīng)

3、用免疫組織化學(xué)染色方法、熒光定量PCR技術(shù)、Western blot技術(shù)，檢測(cè)損傷后不同時(shí)間內(nèi)GFAP、S100B的表達(dá)變化以及與損傷時(shí)間的關(guān)系。擬為法醫(yī)檢案實(shí)踐中顱腦損傷時(shí)間的推斷提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　SPF級(jí)健康的SD（Sprague Dawley，SD）大鼠110只，雌雄不限，體重250g-300g，購(gòu)自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào):SCXK（豫）2015-0004編號(hào):NO.410031000042

4、32]。單獨(dú)籠養(yǎng)于鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周。按照實(shí)驗(yàn)需要將所有大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(20只)和實(shí)驗(yàn)組（90只），實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物按照不同損傷時(shí)間分為3h、6h、12h、1d、3d、7d。實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)顱骨骨折或死亡未計(jì)入實(shí)驗(yàn)組。采用Feeney大鼠腦損傷打擊裝置并進(jìn)行改造制備大鼠閉合性腦損傷模型;對(duì)照組大鼠除不采取打擊操作，其他與實(shí)驗(yàn)組相同。將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組已制備好的大鼠模型分為免疫組化染色組、熒光定量PCR組、Wes

5、tern Blot組分別測(cè)定GFAP、S100B的陽性細(xì)胞表達(dá)、mRNA表達(dá)以及蛋白表達(dá)量。①免疫組織化學(xué)染色組動(dòng)物處理流程如下:用多聚甲醛固定腦組織（經(jīng)心臟灌流操作），石蠟包埋切片，染色。HE染色觀察大鼠腦皮質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變、觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組形態(tài)變化的不同，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)GFAP、S100B陽性細(xì)胞表達(dá)率;②熒光定量PCR組:取損傷灶及周圍5mm內(nèi)腦組織(50g)，編號(hào)存管，放于液氮保存，測(cè)定mRNA時(shí)，先提取總RNA然后反轉(zhuǎn)錄

6、成cDNA最后測(cè)定GFAP-mRNA及S100B-mRNA表達(dá)量;③Westem blot組:取腦組織標(biāo)本同PCR組，提取組織蛋白、測(cè)定蛋白濃度、SDS-PAGE電泳、進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、一抗孵育、二抗孵育、曝光、顯色。
　　結(jié)果：
　　1.行為學(xué)觀察結(jié)果:與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠部分反射消失，出現(xiàn)去皮質(zhì)綜合癥，呼吸淺快，甚至?xí)和?
　　2.腦組織標(biāo)本及含水量結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組大鼠，損傷灶及周圍出現(xiàn)挫傷、出血、水腫;受損傷側(cè)腦組織與對(duì)

7、側(cè)腦組織大小不均;腦組織含水量隨損傷時(shí)間的變化而變化。大鼠腦損傷3h腦含水量逐漸增加，1d時(shí)達(dá)到高峰，此后開始下降。各組腦損傷后腦組織含水量與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);
　　3.大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)HE染色結(jié)果:3h開始可見細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊不清;局限性出血、腫脹、體積增大;細(xì)胞周圍間隙增大;膠質(zhì)細(xì)胞不斷增生;損傷3d開始逐漸恢復(fù)，損傷7d可發(fā)現(xiàn)基本恢復(fù)正常，但與對(duì)照組仍有差別;
　　4.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果:TBI后

8、GFAP、S100B陽性表達(dá)率均在3h時(shí)增高，1d達(dá)到高峰，3d后開始下降，7d仍高于對(duì)照。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);
　　5.熒光定量PCR結(jié)果:TBI后，GFAP mRNA、S100BmRNA表達(dá)在3h時(shí)開始增高，3h-1d持續(xù)增高，1d到最高峰，3d開始下降，7d仍高于對(duì)照組。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);
　　6.Western blot結(jié)果:TBI后，GFAP、S100B蛋白表達(dá)量在3h時(shí)開始增高，

9、1d到最高峰，隨后開始下降，7d仍高于對(duì)照組。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)中改進(jìn)后的自由落體打擊裝置，由于制作簡(jiǎn)易、操作方便、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率低，能夠重復(fù)穩(wěn)定操作，使其對(duì)探索大鼠腦損傷實(shí)驗(yàn)研究有實(shí)用性價(jià)值。
　　2.大鼠顱腦損傷后GFAP、S100B的表達(dá)變化，可為臨床中顱腦損傷的精準(zhǔn)診斷提供依據(jù)。
　　3.大鼠顱腦損傷后，GFAP、S100B兩者隨損傷時(shí)間呈規(guī)律性分布，且有相似