大鼠腦損傷后iNOS和MAP-2的表達(dá)及其與損傷時(shí)間的關(guān)系.pdf

1、目的：隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速增長(zhǎng),社會(huì)活動(dòng)的頻繁增加,尤其是交通事業(yè)的快速發(fā)展,使顱腦創(chuàng)傷成為一種常見的損傷。另外,腦挫傷也是法醫(yī)學(xué)檢案實(shí)踐中常見的一種機(jī)械性腦損傷,因此要建立一個(gè)適當(dāng)?shù)?、符合?shí)際且理想的腦損傷(Traumatic Brain Injury,TBI)模型對(duì)研究腦損傷意義重大。1981年Feeney成功的建立了大鼠腦組織挫傷模型,該模型可以模擬類似于人類臨床上見到的腦挫傷的局灶性損傷。但是該模型在應(yīng)用當(dāng)中還存在一些不足,比如易

2、于出現(xiàn)二次反彈的損傷。本實(shí)驗(yàn)參照Edward介紹的方法,采取顱骨開窗的打擊方式,目的是為了盡量保證動(dòng)物之間損傷的部位和損傷的程度相保持一致。腦挫傷(brain contusion)是一種常見的原發(fā)性腦損傷,指由于外力作用后腦組織在顱內(nèi)作直線加速或減速運(yùn)動(dòng),或旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng),腦表面與顱骨內(nèi)面或顱底碰撞、摩擦而形成。其癥狀一般表現(xiàn)為不同程度的意識(shí)障礙,更嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。正常情況下,腦組織內(nèi)沒(méi)有誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric

3、 oxidesynthase,iNOS)蛋白的表達(dá),在炎癥、缺血、缺氧及創(chuàng)傷情況下受損傷周圍會(huì)出現(xiàn)iNOS蛋白的陽(yáng)性表達(dá),并呈現(xiàn)一定的時(shí)間規(guī)律性,其細(xì)胞定位主要是部分神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及炎性浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞。微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein2,MAP-2)是一種熱穩(wěn)定的磷蛋白,屬于結(jié)構(gòu)性微管相關(guān)蛋白家族,主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元胞體和樹突,是哺乳動(dòng)物腦中最豐富的蛋

4、白之一。MAP-2是神經(jīng)元缺血損傷的敏感指標(biāo),可作為顱腦創(chuàng)傷神經(jīng)元損傷的早期標(biāo)記物。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬大鼠腦挫傷模型,應(yīng)用免疫組織化學(xué)(SP)染色的方法,檢測(cè)實(shí)驗(yàn)性大鼠腦挫傷后不同時(shí)間內(nèi)iNOS和MAP-2蛋白表達(dá)及其與損傷經(jīng)過(guò)時(shí)間的關(guān)系,可望為法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中對(duì)顱腦損傷時(shí)間的推斷提供科學(xué)的理論依據(jù)。
　　 方法：⑴將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組(5只)和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組按損傷后3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、1天、3天、5天、7天和14天8個(gè)時(shí)間點(diǎn)

5、分組,每組6只。⑵利用改造的Edward自由落體裝置,撞擊大鼠頭部制造腦挫傷模型,記錄動(dòng)物的行為學(xué)變化,在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取腦組織,并固定做石蠟埋塊。⑶在HE染色觀察的基礎(chǔ)上,采用免疫組化(SP法)觀察損傷后不同時(shí)間內(nèi)iNOS和MAP-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)的變化,利用Image-Pro Plus5.0進(jìn)行圖像分析,測(cè)量挫傷灶周圍iNOS和MAP-2的陽(yáng)性細(xì)胞率,并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。⑷統(tǒng)計(jì)分析:所有數(shù)據(jù)用-x±s表示,用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行

6、單因素方差分析,采用LSD～t法進(jìn)行兩兩比較,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果：①受打擊損傷后多數(shù)大鼠出現(xiàn)短暫昏迷,心率發(fā)生改變,自主呼吸由慢接近正常,蘇醒后緩慢跑動(dòng),且反應(yīng)遲鈍。②損傷后早期(＜1d),可見挫傷周圍局部蛛網(wǎng)膜下腔出血,大腦皮層內(nèi)有多個(gè)大小不一、散在的出血灶,部分伴有腦組織輕度水腫。在傷后3天,大腦皮質(zhì)及海馬內(nèi)可見以神經(jīng)元細(xì)胞腫脹、變性、壞死,周圍膠質(zhì)細(xì)胞增生為主要病理改變。腦損傷后7天,腦組織內(nèi)壞死神經(jīng)元增多

7、,呈灶狀,膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生,可見明顯的膠質(zhì)瘢痕。對(duì)照組末見明顯改變。③損傷后iNOS的表達(dá)變化觀察,對(duì)照組中未見著色陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn),而在實(shí)驗(yàn)組的挫傷灶周圍區(qū)域,皮質(zhì)、海馬和齒狀回及胼胝體存在iNOS陽(yáng)性染色細(xì)胞,表達(dá)區(qū)域主要集中在損傷皮質(zhì)周圍及海馬。腦創(chuàng)傷后iNOS的活性明顯提高。傷后6小時(shí)即可見散在的梭形或三角形的iNOS陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn);傷后1天,在皮質(zhì)和海馬區(qū)iNOS的陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組顯著增加(P＜0.05);在損傷后3天表達(dá)達(dá)到高峰

8、(P＜0.05),傷后5天iNOS陽(yáng)性表達(dá)有所下降,傷后14天在損傷灶周圍仍見有iNOS陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。④損傷后MAP-2的表達(dá)變化觀察,在正常對(duì)照組中,MAP-2的染色細(xì)胞主要位于神經(jīng)元的胞體和樹突,陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黃色。MAP-2在腦損傷后3小時(shí)表達(dá)明顯下降(P＜0.05),在傷后1天MAP-2蛋白丟失達(dá)到高峰(P＜0.05),傷后3天MAP-2蛋白開始恢復(fù)表達(dá),且于傷后5天逐漸增加,到傷后14天損傷灶周圍的表達(dá)接近正常組(P＜0.05)

9、。
　　 結(jié)論：⑴本實(shí)驗(yàn)利用改造的Edward自由落體打擊裝置,模擬大鼠腦挫傷動(dòng)物模型,在HE染色的基礎(chǔ)上,對(duì)大鼠腦組織進(jìn)行鏡下病理學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)符合腦挫傷的組織病理形態(tài)學(xué)改變,腦挫傷動(dòng)物模型制作成功。⑵腦損傷后iNOS和MAP-2的表達(dá)強(qiáng)度均與損傷經(jīng)過(guò)時(shí)間之間密切相關(guān),并呈現(xiàn)出一定的時(shí)間規(guī)律性,可望作為推斷腦損傷時(shí)間的參考指標(biāo)。⑶在腦損傷后,iNOS和MAP-2兩項(xiàng)免疫組織化學(xué)指標(biāo)均有陽(yáng)性物質(zhì)的出現(xiàn)、高峰和下降的過(guò)程,并且此過(guò)程