TLR4在創(chuàng)傷性腦損傷急性炎癥損傷中的作用機(jī)制及姜黃素的保護(hù)效應(yīng)研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)，是神經(jīng)外科常見的一種急重癥，其發(fā)生率無論平時(shí)還是戰(zhàn)時(shí)都非常高，死亡率及致殘率均高居各類創(chuàng)傷首位。除了原發(fā)性腦損傷引起的腦組織結(jié)構(gòu)破壞，包括神經(jīng)炎癥反應(yīng)、自由基堆積、興奮性氨基酸中毒、線粒體功能障礙、鈣超載等繼發(fā)性腦損傷顯著影響TBI神經(jīng)損傷程度。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明神經(jīng)炎癥反應(yīng)在TBI急性期迅速發(fā)生，并能持續(xù)很長一段時(shí)間，在TBI繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮重要的雙刃劍作用。目前

2、大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，腦損傷急性期過度的神經(jīng)炎癥反應(yīng)不利于神經(jīng)細(xì)胞尤其是神經(jīng)元的存活及修復(fù)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞及組織損傷加重。因此對(duì)TBI急性期損傷腦區(qū)過度炎癥反應(yīng)的有效調(diào)控成為干預(yù)TBI神經(jīng)損傷的一條重要策略。
　　在單核巨噬細(xì)胞等外周循環(huán)中的免疫細(xì)胞通過遭受破壞的血腦屏障進(jìn)入損傷腦組織引起神經(jīng)組織炎癥反應(yīng)的同時(shí)，同屬于單核巨噬細(xì)胞系的神經(jīng)系統(tǒng)原位的免疫細(xì)胞——小膠質(zhì)細(xì)胞在損傷細(xì)胞釋放的多種內(nèi)源性刺激物的刺激下，出現(xiàn)阿米巴樣形態(tài)改變，可以吞

3、噬清除壞死的神經(jīng)細(xì)胞碎片，還可釋放多種炎癥因子、趨化因子等，廣泛參與誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)神經(jīng)免疫反應(yīng)。既往研究報(bào)道小膠質(zhì)細(xì)胞胞膜廣泛表達(dá)Toll樣受體(tolllike receptors，TLRs)。TLRs能識(shí)別細(xì)菌、病毒、真菌等表達(dá)的病原相關(guān)分子模式，引發(fā)固有免疫反應(yīng)，在病原體感染性疾病中發(fā)揮重要作用。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)TLRs還廣泛參與細(xì)胞損傷后產(chǎn)生釋放的蛋白、多肽、核酸等內(nèi)源性的危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(danger-associated mo

4、lecular pattern，DAMPs)的識(shí)別及免疫信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動(dòng)非感染性的固有免疫反應(yīng)。其中TLR4亞型是目前神經(jīng)系統(tǒng)固有免疫研究的熱點(diǎn)，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括MyD88依賴和非依賴兩條途徑。在MyD88依賴的信號(hào)途徑中，TLR4接受的胞外信號(hào)通過MyD88分子經(jīng)下游的白介素-1受體相關(guān)激酶(interleukin-1 receptor associated kinases，IRAK)、轉(zhuǎn)化生長因子β激酶1(transforming

5、 growth factor-β activated kinase1，TAK1)等分子向下進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起核因子-κB抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor-κB，IκB)磷酸化降解，導(dǎo)致NF-κB(尤其是p65亞單位)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，啟動(dòng)各類炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白合成，積極參與到神經(jīng)免疫炎癥反應(yīng)中。
　　祖國醫(yī)學(xué)博大精深，是醫(yī)學(xué)研究者取之不盡、用之不竭的巨大寶庫。其中，姜科姜黃屬植物姜黃是天然抗氧

6、化、抗炎中草藥，在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)及印度醫(yī)學(xué)中已經(jīng)有數(shù)千年的應(yīng)用歷史，姜黃素就是從其根莖提純出來的一種有效活性成分。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)姜黃素具有強(qiáng)大的抗炎作用，能促進(jìn)炎癥損傷組織的修復(fù)。近年來已開始逐漸深入到各類神經(jīng)系統(tǒng)損傷的相關(guān)研究中，雖有零星報(bào)道觀察到姜黃素對(duì)TBI神經(jīng)損傷有明顯保護(hù)作用，但機(jī)制不清，尤其是姜黃素對(duì)TBI急性期神經(jīng)炎癥的調(diào)控作用及其可能調(diào)節(jié)機(jī)制存在大量未知。推測姜黃素的神經(jīng)炎癥調(diào)控作用可能通過影響小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和功能來實(shí)

7、現(xiàn)。
　　基于此，本課題研究采用免疫組織化學(xué)、免疫印跡、細(xì)胞共培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附檢測、FJB及TUNEL染色等技術(shù)方法，首先對(duì)比檢測了野生型和TLR4基因敲除(TLR4-/-)型小鼠TBI急性期24h時(shí)神經(jīng)功能及神經(jīng)元損傷情況，以及損傷腦組織炎癥因子含量，為明確TLR4調(diào)控TBI急性期神經(jīng)炎癥反應(yīng)進(jìn)而影響神經(jīng)元死亡及神經(jīng)功能提供有利證據(jù);然后采取TBI后腹腔注射姜黃素處理，同樣觀察24h時(shí)神經(jīng)損傷及損傷區(qū)神經(jīng)炎癥的變化情況，以及T

8、LR4在膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況和TLR4通路信號(hào)分子的表達(dá)變化，揭示TLR4在姜黃素減輕TBI急性期過度神經(jīng)炎癥中的可能作用;最后利用體外原代小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)方式，予脂多糖及姜黃素處理，觀察小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)、胞膜TLR4表達(dá)、炎癥因子分泌的變化對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞損傷的影響，以及小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4通路信號(hào)分子的表達(dá)變化情況，證實(shí)姜黃素能通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4表達(dá)而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化，進(jìn)而減輕神經(jīng)元炎性損傷，并對(duì)其可能的信號(hào)通

9、路進(jìn)行了初步研究，主要結(jié)果如下:
　　1.所有實(shí)驗(yàn)小鼠于TBI后2h左右能完全蘇醒，清醒后其一般活動(dòng)與進(jìn)食行為均減弱。術(shù)后24h頭部切口愈合良，未發(fā)生感染現(xiàn)象及動(dòng)物死亡，術(shù)后存活率達(dá)百分之百。
　　2.創(chuàng)傷側(cè)腦組織TLR4表達(dá)于TBI后6h可見明顯升高，后繼續(xù)逐漸升高直至24h達(dá)到頂峰。之后TLR4表達(dá)開始下降，于72h時(shí)TLR4表達(dá)仍顯著高于0h。
　　3.TBI后24h，野生型及TLR4-/-型小鼠神經(jīng)功能缺損及腦

10、水腫明顯，但TLR4-/-型小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分及腦組織含水量顯著低于野生型。野生型及TLR4-/-型小鼠創(chuàng)傷周圍腦組織可見大量TUNEL陽性、FJB陽性細(xì)胞，TLR4-/-小鼠TUNEL陽性細(xì)胞與DAPI陽性細(xì)胞之百分比、FJB陽性細(xì)胞數(shù)目均顯著低于野生型小鼠。
　　4.與各自假手術(shù)組比較，TBI后24h野生型及TLR4-/-型小鼠創(chuàng)傷周圍腦組織中IL-1β、IL-6、MCP-1、RANTES等炎癥因子含量顯著增多，但TLR4-/

11、-組的各炎癥因子含量均顯著低于野生組。
　　5.TBI后15 min腹腔注射不同濃度的姜黃素，100mg/kg濃度姜黃素處理的小鼠創(chuàng)傷腦組織TLR4蛋白表達(dá)顯著低于未給藥組及50mg/kg濃度組。而200mg/kg濃度組的創(chuàng)傷腦組織TLR4蛋白表達(dá)也較未給藥組明顯降低，但與100mg/kg濃度組比較則無顯著差異。
　　6.TBI后24h，100mg/kg姜黃素處理組小鼠的神經(jīng)功能障礙評(píng)分及腦組織含水量顯著低于對(duì)照劑處理組。姜

12、黃素處理組小鼠TUNEL陽性細(xì)胞與DAPI陽性細(xì)胞之百分比、FJB陽性細(xì)胞數(shù)目均顯著低于對(duì)照劑處理組。
　　7.與各自假手術(shù)組比較，TBI后24h姜黃素處理組及對(duì)照劑處理組小鼠創(chuàng)傷周圍腦組織中IL-1β、TNF-α、MCP-1、RANTES等炎癥因子含量顯著增多，但姜黃素處理組的各炎癥因子含量均顯著低于對(duì)照劑處理組。
　　8.TBI后24h，創(chuàng)傷后予對(duì)照劑或姜黃素處理組小鼠創(chuàng)傷周圍腦組織均可見大量TLR4與CD11b陽性共表

13、達(dá)的小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞，同時(shí)TLR4免疫陽性強(qiáng)。而這些CD11b陽性細(xì)胞，胞體明顯變大，突起也變粗變短。但姜黃素處理組的TLR4陽性小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞數(shù)目顯著低于對(duì)照劑處理組。
　　9.與各自假手術(shù)組比較，創(chuàng)傷后予對(duì)照劑及姜黃素組小鼠創(chuàng)傷周圍腦組織TLR4、MyD88、p-Iκ B-α，NF-κB等蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，但姜黃素處理組的TLR4、MyD88、p-IκB-α，NF-κB等蛋白表達(dá)均顯著低于對(duì)照劑組。而兩創(chuàng)傷組腦組織IκB-α

14、t的蛋白表達(dá)則較兩假手術(shù)組均明顯下調(diào)，但創(chuàng)傷后給予姜黃素組的腦組織Iκ B-α蛋白表達(dá)顯著高于給予對(duì)照劑組。
　　10.0.5μM，1μM，2μM及5μM濃度的姜黃素對(duì)元代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞活力無明顯影響，而10μM濃度姜黃素則顯著降低小膠質(zhì)細(xì)胞活性;而5μM及10μM濃度姜黃素均顯著降低原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞活性。故本部分實(shí)驗(yàn)選擇最佳濃度2μM姜黃素對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行處理。
　　11.單獨(dú)神經(jīng)元培養(yǎng)中，脂多糖(LPS)刺激后神經(jīng)元

15、的胞體明顯變小，突起也大量減少，不能形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);而經(jīng)姜黃素處理后，其形態(tài)破壞與對(duì)照劑處理組相比略有改善，但改善程度并不十分明顯。在神經(jīng)元與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中，LPS刺激后神經(jīng)元的形態(tài)破壞程度較單培養(yǎng)組更嚴(yán)重;而予姜黃素處理后，共培養(yǎng)的神經(jīng)元形態(tài)破壞得以明顯改善。
　　12.單獨(dú)神經(jīng)元培養(yǎng)中，LPS刺激后神經(jīng)元的caspase3表達(dá)明顯上調(diào);而經(jīng)姜黃素處理后，caspase3表達(dá)無明顯差異。在神經(jīng)元與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中，L

16、PS刺激后神經(jīng)元的caspase3表達(dá)較單培養(yǎng)組顯著增多;而予姜黃素處理后，共培養(yǎng)的神經(jīng)元caspase3表達(dá)則顯著下降。
　　13.經(jīng)LPS刺激后，可見大量TLR4與CD11b陽性共表達(dá)的小膠質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)表達(dá)的TLR4免疫陽性較強(qiáng)，而這些小膠質(zhì)細(xì)胞與對(duì)照組相比，胞體明顯變大，突起也變粗變短;予姜黃素處理后，小膠質(zhì)細(xì)胞雖仍可見大量TLR4與CD11b共表達(dá)，但TLR4免疫熒光強(qiáng)度顯著降低，且細(xì)胞胞體變大及突起變短變粗的程度明顯緩解

17、。
　　14.LPS刺激共培養(yǎng)細(xì)胞，24h時(shí)IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1、RANTES濃度顯著升高，經(jīng)姜黃素處理組的IL-Iβ、IL-6、RANTES濃度顯著低于對(duì)照劑處理組。
　　15.LPS刺激后小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TLR4及其下游分子MyD88、p-Iκ B-α，NF-κB等蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，IκB-α的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，但姜黃素處理后的TLR4、MyD88、p-Iκ B-α，NF-κB等蛋白表達(dá)的上調(diào)程度顯著

18、降低，IκB-α蛋白表達(dá)的下調(diào)程度也顯著降低。
　　本課題初步闡明了急性期神經(jīng)炎癥反應(yīng)對(duì)TBI神經(jīng)損傷的影響，進(jìn)一步揭示了TLR4對(duì)急性期神經(jīng)炎癥及神經(jīng)損傷的調(diào)控作用，為探索TBI治療的新藥物及靶點(diǎn)提供了重要依據(jù)。而且，本課題證明姜黃素（中草藥姜黃的有效成分提取物）對(duì)TBI急性期神經(jīng)損傷的改善作用至少部分是通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4信號(hào)通路抑制過度的神經(jīng)炎癥反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的，拓展了姜黃素的治療范圍，也為深入探究姜黃素治療TBI的可能藥