CD49f在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的作用及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)因其來源廣泛，并具有多向分化能力和免疫調(diào)節(jié)功能成為最具臨床應(yīng)用前景的成體干細(xì)胞。深入了解MSCs的表面標(biāo)志對于MSCs的分離、純化、鑒定、功能研究以及最終在臨床治療應(yīng)用中細(xì)胞類型的選擇都具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。雖然CD73、CD90、CD105等標(biāo)志成為MSCs公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，但這些標(biāo)志并不能反映MSCs自我更新、多向分化以及對微環(huán)境敏感性等“干性”特點(diǎn)。前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)粘附分子CD49f

2、（integrinα6）在胎兒和成人骨髓來源的MSCs(BMSCs)中呈差異性表達(dá)。粘附分子做為一類重要的細(xì)胞膜表面蛋白，其介導(dǎo)的干細(xì)胞與其微環(huán)境中支持細(xì)胞或ECM之間的相互作用是干細(xì)胞保持其干性的關(guān)鍵。CD49f不僅是一個干性相關(guān)基因，可作為多種干細(xì)胞的表面標(biāo)志，如胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞等，而且通過與微環(huán)鏡中ECM成分laminin的結(jié)合在干細(xì)胞自我更新與干性維持中發(fā)揮重要作用。目前，CD49f在MSCs中的相關(guān)研究還很少

3、，胎兒來源BMSCs中CD49f+細(xì)胞的富集是否是一類MSCs前體細(xì)胞以及CD49f能否做為BMSCs的干性標(biāo)志等有待闡明;同時，作為微環(huán)境中重要組成部分，炎癥因子可通過對粘附分子的調(diào)節(jié)將微環(huán)境中生理或病理性信號傳導(dǎo)至干細(xì)胞，CD49f是否在BMSCs感知微環(huán)境中炎癥信號并調(diào)整自身生物學(xué)特性以滿足機(jī)體需求的過程中發(fā)揮作用等問題還需進(jìn)一步研究。
　　研究目的:
　　1.檢測BMSCs中CD49f+和CD49f-細(xì)胞群體在自我更

4、新和多向分化能力方面的差異，明確CD49f是否可作為BMSCs的干性表面標(biāo)志。
　　2.明確炎癥因子對CD49f的調(diào)控以及CD49f在BMSCs感知周圍環(huán)境中炎癥信號并調(diào)整其生物學(xué)特性過程中的作用。
　　3.深入探討TNF-α調(diào)控BMSCs中CD49f表達(dá)的機(jī)制。
　　研究方法和結(jié)果:
　　1.CD49f與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的干性
　　方法:分別應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和Real-Time PCR的方法檢測CD49f在

5、不同來源和不同分化能力的干細(xì)胞/細(xì)胞中的表達(dá);通過連續(xù)傳代的方式觀察CD49f的動態(tài)變化過程以及對環(huán)境的敏感性;應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選CD49f+及CD49f-BMSCs細(xì)胞群體，通過克隆形成實(shí)驗(yàn)及成骨、成脂分化誘導(dǎo)對比二者自我更新和多向分化能力的差異。
　　結(jié)果:胎兒BMSCs及皮膚成纖維細(xì)胞中CD49+細(xì)胞比例及mRNA表達(dá)水平遠(yuǎn)高于成人相應(yīng)細(xì)胞，而人胚胎干細(xì)胞(hESCs)及羊膜上皮細(xì)胞基本全部表達(dá)CD49f,且mRNA表達(dá)水平

6、也較高;體外培養(yǎng)的胎兒BMSCs在形態(tài)學(xué)以及國際細(xì)胞治療協(xié)會定義的表面標(biāo)志表達(dá)水平同成人BMSCs一致;隨著體外傳代的增加，CD49f+細(xì)胞比例呈下降趨勢，且這種下降是由于CD49f本身降低所至;CD49f+細(xì)胞亞群的克隆形成和分化能力均強(qiáng)于CD49f-細(xì)胞。
　　2.CD49f與炎癥因子對BMSCs生物學(xué)特性的影響
　　方法:以BMSCs體外培養(yǎng)過程中加入不同種類和濃度的炎癥因子進(jìn)行刺激為模型，利用流式細(xì)胞術(shù)、Real-T

7、ime PCR和Western Blot的方法檢測CD49f的改變情況;檢測炎癥因子對BMSCs分化能力的影響，通過將CD49f敲減和過表達(dá)驗(yàn)證其在BMSCs分化能力維持中的作用;采用細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測BMSCs對CD49f配體laminin的粘附能力及炎癥因子對其的影響，通過功能性封閉性抗體驗(yàn)證CD49f在其中發(fā)揮的作用;應(yīng)用免疫共沉淀篩選CD49f結(jié)合蛋白，并探討其與BMSCs炎癥環(huán)境下粘附和遷移等行為的關(guān)系。
　　結(jié)果:TNF

8、-α處理BMSCs后可導(dǎo)致CD106的上調(diào)和CD49f的下調(diào)，其中CD49f異構(gòu)體A的下降作用明顯，而異構(gòu)體B則無顯著改變;而TGF-β1則可下調(diào)CD106的表達(dá)，對CD49f無明顯影響;TNF-α降低BMSCs的成骨成脂分化能力，CD49f特別是異構(gòu)體A的過表達(dá)可促進(jìn)BMSCs的分化能力，CD49f敲減后其分化能力相應(yīng)減弱;CD49f介導(dǎo)BMSCs與laminin的粘附，TNF-α誘導(dǎo)的CD49f下降可使BMSCs與laminin的粘

9、附能力減弱;TNF-α誘導(dǎo)BMSCs遷移能力增加，TG2可與CD49f特異性結(jié)合，且TNF-α處理后TG2表達(dá)升高。
　　3.TNF-α調(diào)控CD49f表達(dá)的機(jī)制
　　方法:加入TNF-α刺激BMSCs后在不同時間點(diǎn)收集細(xì)胞，應(yīng)用western blot、免疫熒光及免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測NF-κB和mTOR信號通路中各級分子的活化情況;分別應(yīng)用NF-κB特異性抑制劑SN50及mTOR抑制劑rapamycin和PP242預(yù)處理B

10、MSCs后再進(jìn)行TNF-α刺激，通過檢測關(guān)鍵分子的活化情況判斷相應(yīng)信號通路是否被特異性抑制;同時，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測上述抑制劑預(yù)處理的BMSCs經(jīng)TNF-α刺激后以及正常培養(yǎng)傳代過程中CD49f的改變情況，以判斷何種信號通路在CD49f的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　結(jié)果:TNF-α處理后BMSCs中NF-κB和mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均被活化;SN50可特異性抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB p65的核移位，rapamycin和PP242

11、可特異性抑制mTOR及其下游效應(yīng)分子S6K1及AKT的活化;rapamycin和PP242預(yù)處理的BMSCs中TNF-α誘導(dǎo)的CD49f下降明顯減弱，而SN50則無此作用;此外，rapamycin和PP242還可抑制體外傳代過程中CD49f的下降。
　　研究結(jié)論:
　　1.CD49f在胎兒時期BMSCs中的表達(dá)遠(yuǎn)多于成人BMSCs; CD49f對環(huán)境變化敏感，體外培養(yǎng)使其呈下降趨勢;以CD49f為表面標(biāo)志分選的CD49f+B

12、MSCs克隆形成及分化能力強(qiáng)于CD49f-細(xì)胞，CD49f可做為BMSCs的干性標(biāo)志。
　　2.TNF-α以濃度依賴性的方式使BMSCs中CD49f下降，CD49f的下降與炎癥環(huán)境下BMSCs分化能力的減弱密切相關(guān);CD49f介導(dǎo)BMSCs粘附于laminin，CD49f可與TG2特異性結(jié)合;TNF-α處理的BMSCs與laminin粘附能力減弱，而跨膜遷移能力的增加，這種變化與CD49f的下降和TG2的升高密切相關(guān)。
　　

13、3.TNF-α可引起B(yǎng)MSCs中NF-κB和mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，相應(yīng)信號通路的抑制劑對TNF-α誘導(dǎo)的BMSCs中NF-κB和mTOR信號通路的活化具有抑制作用;但是僅有mTOR信號通路抑制劑rapamycin和PP242可抑制TNF-α誘導(dǎo)的CD49f下降，說明mTOR在CD49f的調(diào)控中具有重要作用。
　　4.CD49f作為BMSCs干性表面標(biāo)志的確立為臨床疾病治療中MSCs的選擇提供了一種新的分選標(biāo)志;CD49f在炎