骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力的影響和機(jī)制.pdf

1、目的： 1.建立從Lewis大鼠骨髓中分離、培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，并對(duì)分離、培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 　　2.研究鼠源乙酰膽堿受體α亞基97-116(Ra97-116)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力(EAMG)動(dòng)物模型的可能性，為MG的基礎(chǔ)研究提供簡(jiǎn)便實(shí)用的動(dòng)物模型。 3.研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力臨床和免疫功能的影響和機(jī)制，為MG的細(xì)胞移植治療提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。 方法：

2、 采用全骨髓培養(yǎng)法從Lewis大鼠骨髓中分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)貼壁法體外擴(kuò)增、傳代和流式細(xì)胞儀鑒定MSCs。采用人工合成的Ra97-116肽段與完全弗氏佐劑(CFA)充分乳化后多點(diǎn)皮下注入6-8周齡雌性Lewis鼠，并在第30、60天強(qiáng)化注射與不完全弗氏佐劑(IFA)充分混合后的等量肽段構(gòu)建EAMG。對(duì)照組同期注入等量磷酸緩沖液(PBS)。通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)鼠體重變化，并進(jìn)行Lennon臨床評(píng)分；通過(guò)低頻重復(fù)電刺激檢查電衰減反應(yīng)和EL

3、JSA法檢測(cè)血清AchR-Ab滴度變化來(lái)確定EAMG是否成模。第三次免疫后一周后，將20只成模的EAMG鼠隨機(jī)分為移植治療組和EAMG對(duì)照組，分別給予MSCs 1×106/100gLPBS尾靜脈回輸，EAMG對(duì)照組給予1001μLPBS。自移植之日起，每日同一時(shí)間對(duì)移植組與EAMG對(duì)照組大鼠稱(chēng)重和Lennon臨床評(píng)分。移植后第二周檢測(cè)兩組血清AehR-Ab，移植后第三周流式細(xì)胞儀檢測(cè)移植組、EAMG對(duì)照組以及同周齡健康Lewis大鼠CD

4、28、CTLA4、CD25在各組外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)。 結(jié)果： 1.原代培養(yǎng)的MSCs于24h后貼壁,48～72h形成集落，7～10d可達(dá)到70％～80％融合。第5代MSCs有97.5％表達(dá)CD90抗原，1.72％表達(dá)CD45抗原。 2.EAMG組中70％Lewis鼠Lennon臨床評(píng)分在1級(jí)以上，3、5Hz低頻重復(fù)電刺激陽(yáng)性電衰減反應(yīng)D5>10％，血清AchR－Ab滴度與正常對(duì)照血清比值>2.1。

5、證實(shí)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物EAMG成模率達(dá)70％。 3.經(jīng)MSCs移植治療15天后，治療組EAMG大鼠體重較對(duì)照組大鼠明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。 4.經(jīng)MSCs移植治療13天后，治療組EAMG臨床評(píng)分下降，與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。 5.經(jīng)MSCs移植治療兩周后，治療組AChR-AbIgGOD值(0.884±0.32)明顯下降，與對(duì)照組(1.364±0.26)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)

6、。 6.經(jīng)MSCs移植后第三周，治療組CD4+T淋巴細(xì)胞表面CD28表達(dá)已低于對(duì)照EAMG組(p<0.05)，并且與健康組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別(p>0.05)，EAMG大鼠CD28表達(dá)較正常健康組有所上升(p<0.05)。治療組CD4+T淋巴細(xì)胞表面CTLA-4表達(dá)均顯著高于對(duì)照EAMG組和健康組P<0.01)，EAMG大鼠CTLA-4表達(dá)較正常健康組有所上升(p<0.05)。治療組CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞比率較對(duì)照EAMG組

7、和健康組顯著升高(p<0.01)，EAMG大鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞較正常健康組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差別(p>0.05)。 結(jié)論： 1.貼壁篩選培養(yǎng)法能夠成功分離、純化以及擴(kuò)增得到細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)所需要的MSCs。 2.用人工合成鼠源肽段R97-116免疫Lewis鼠可成功誘導(dǎo)EAMG模型，為MG的研究奠定了基礎(chǔ)。 3.MSCs移植可以有效地減輕EAMG的癥狀，降低AChR-Ab滴度，是一種簡(jiǎn)便可行的干預(yù)方